國慶1號溫州密柑愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中生理生化特性研究

蔡小東，李 玲，劉 敏(長江大學園藝園林學院,湖北 荊州434025)

國慶1號溫州密柑愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中生理生化特性研究

蔡小東，李 玲，劉 敏(長江大學園藝園林學院,湖北 荊州434025)

探討了液體懸浮培養(yǎng)不同時間的國慶1號溫州蜜柑(CitrusunshiuMarc.cv.Guoqing No.1)愈傷組織可溶性蛋白質含量、可溶性還原糖含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性的變化。結果表明：可溶性蛋白含量在培養(yǎng)9d時達到高峰，可溶性還原糖含量在培養(yǎng)6d時達到高峰，SOD和POD活性在培養(yǎng)前期活性較低，在培養(yǎng)第9d達到高峰。可溶性蛋白、可溶性還原糖含量與這2種酶的活性變化趨勢相近，由此表明在愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中，這些物質含量或活性的變化可為確定柑橘愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)最佳繼代周期提供依據(jù)。

國慶1號溫州蜜柑(CitrusunshiuMarc.cv.Guoqing No.1)；愈傷組織；可溶性蛋白質；可溶性還原糖；超氧化物歧化酶；過氧化物酶

植物快繁技術是生物技術中最具實用價值的領域之一[1]。采用組織培養(yǎng)技術進行快繁與育種在許多植物中已經(jīng)取得一定的成功，其中通過胚狀體發(fā)生途徑(由愈傷組織再分化形成體細胞胚狀體)是包括柑橘在內的許多植物再生完整植株的一條有效途徑[1]。愈傷組織及其細胞懸浮系遺傳背景較一致，來源穩(wěn)定，且取材不受時間限制，可長期繼代保存，是組織培養(yǎng)、原生質體相關操作以及遺傳轉化等研究的理想起始材料。有關愈傷組織培養(yǎng)過程中相關代謝物質前人已進行了許多研究，植物愈傷組織培養(yǎng)以及懸浮細胞生長與代謝特征的相關研究也越來越多[2-5]。本研究通過測定國慶1號溫州蜜柑(CitrusunshiuMarccv.Guoqing No.1)愈傷組織懸浮培養(yǎng)不同時間的可溶性蛋白質含量、可溶性還原糖含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性，以從生理生化層次揭示柑橘愈傷組織的生長發(fā)育特征，從而確定柑橘愈傷組織懸浮培養(yǎng)過程中繼代培養(yǎng)的最佳周期，為利用愈傷組織再生體系進行柑橘快繁或育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

國慶1號溫州密柑愈傷組織來源于華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組，現(xiàn)保存于長江大學楚天學者及園藝植物逆境生理實驗室。

1.2 試驗方法

采用單因素試驗設計。先將轉國慶1號愈傷組織在MT固體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，再將約1g愈傷組織轉至于液體培養(yǎng)基(MT + 1.5g/L谷氨酰胺 + 0.5g/L麥芽糖提取物(Malt extrat,ME)+ 40g/L蔗糖)中，在搖床轉速為110r/min，溫度為25℃的條件下進行暗培養(yǎng)；分別在培養(yǎng)后0、3、6、9、12、15d取樣，以培養(yǎng)0d為對照，共6個處理，每個處理重復3次。在培養(yǎng)過程中，每次隨機取3瓶，每次取得的材料先在液氮中迅速冷凍，再于-70℃的超低溫冰箱中保存。15d后全部材料取完再測其代謝指標的含量，每項指標重復測定3次。

1.3 可溶性糖含量的測定

以葡萄糖作標準曲線，采用蒽酮比色法[5]測定液體懸浮培養(yǎng)不同時間的愈傷組織可溶性糖含量。

1.4 可溶性蛋白質含量、SOD活性及POD活性的測定

分別取0.4g愈傷組織于預冷的研缽中，加入10ml預冷的50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8)，在冰浴下研磨成勻漿，10000r/min離心15min，取上清液用于可溶性蛋白質含量、SOD活性及POD活性的測定。可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250法[5]；SOD活性的測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法[6]測定，以抑制NBT光化還原50%的酶用量為1個酶活性單位；采用愈創(chuàng)木酚法測定[6]POD活性，以1min內光密度D470nm變化0.01為1個酶活性單位。

上述各指標測定數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件處理，以LSD法作多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 可溶性蛋白含量的變化

圖1 不同培養(yǎng)時間可溶性蛋白含量的變化

圖2 不同培養(yǎng)時間可溶性還原糖含量的變化

由圖1可以看出，國慶1號溫州蜜柑愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中，可溶性蛋白質含量在0～3d開始增加，增加速度較快，在3～6d內大幅度增加，并且在第9d達到最大值，9d以后逐漸下降。

2.2 可溶性還原糖含量的變化

由圖2可以看出，國慶1號溫州蜜柑愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中，可溶性還原糖含量在0～3d開始呈上升趨勢，在3～6d急劇上升，增加幅度較大；在培養(yǎng)第6d時增加到最大值，隨后又逐漸降低。

2.3 SOD活性的變化

愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中SOD活性的變化情況如圖3所示。由圖3可見，隨著培養(yǎng)時間的增加，愈傷組織中SOD活性表現(xiàn)出有規(guī)律的變化，呈現(xiàn)低-高-低的變化趨勢。在0～3d國慶1號愈傷組織中SOD活性開始增加，增加速度較快，并保持在40～70U/g之間變動；在6～9d增加幅度最快快，并在第9d達到高峰，隨后9～12d又逐漸下降，但仍保持較高水平。總體上，愈傷組織在液體懸浮培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)前期SOD性較培養(yǎng)后期活性低。

2.4 POD活性的變化

在愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中POD活性的變化情況如圖4所示。由圖4可見，在培養(yǎng)3d內POD活性急劇下降，在第3d達到最小值；3～9d一直呈上升趨勢，增長速度較快；在第9d達到最大值，隨后P又逐漸下降，在12～15d在18～20U/g FW之間變動，但仍保持較高水平。

3 討論

很多學者對愈傷組織培養(yǎng)進行了研究。張向前等[7]對棗樹的愈傷組織培養(yǎng)的研究表明，蛋白質和糖是愈傷組織細胞生長增殖的基礎物質，它們的含量變化趨勢是相同的；陳紅等[8]對刺梨花藥愈傷組織培養(yǎng)過程中生理生化特性的研究也表明這幾種代謝物質含量的變化與愈傷組織生長的周期的曲線基本一致。一般而言，在一個培養(yǎng)周期內懸浮培養(yǎng)體系中愈傷組織生長量有一個快速增殖期 [8-10]。本研究中，以MT為培養(yǎng)基進行國慶1號愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)所得到的結果與前人的研究結果基本一致[7-10]，即在國慶1號愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中，可溶性蛋白與可溶性糖的變化趨勢是非常相似的；在培養(yǎng)的第0～3d，可溶性蛋白和可容性糖的含量增長不明顯，這可能是愈傷組織適應新的培養(yǎng)環(huán)境的結果，其代謝能力較弱；第6～9d迅速增長，第9～12d以后逐漸下降，說明蛋白質和糖正在被迅速地分解利用，從而為愈傷組織的分裂增殖提供能量，也反映出愈傷組織生長速度在這段時間內最快；12d以后，液體培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分被逐漸消耗，積累的有害成分逐漸引起愈傷組織的緩慢生長，表現(xiàn)為愈傷組織褐化逐漸加重，需要及時進行繼代培養(yǎng)。POD和SOD活性的高低與植物細胞的分化發(fā)育、植物體的耐鹽性、抗熱性和抗病性等方面關系密切[11-13]。本研究中，SOD的活性含量也是處在不斷增長狀態(tài)，0～9d可溶性蛋白和可溶性糖的含量在不斷增加，SOD活性含量值也在不斷增加，而POD的活性含量在不斷下降，其中SOD以第6～9d增長的速度最快，POD在第12d后又開始上升。這說明愈傷組織的分裂和增殖需要蛋白質和糖的快速合成，以提供物質基礎。這也反映這段時間愈傷組織生長最快，到第12d后蛋白質和糖的含量在不斷的減少后，其活性值也開始慢慢地有所下降。

在植物組織培養(yǎng)過程中常常會出現(xiàn)愈傷組織褐化、不分化或分化率低以及白化苗等問題。通過對植物細胞組織培養(yǎng)物的不同發(fā)育階段保護酶活性及其相關物質含量變化的探討，為今后選擇植物愈傷組織的最適培養(yǎng)條件提供了重要的參考依據(jù)，也為有機體的順利發(fā)育探討提供了有效手段。

圖3 不同培養(yǎng)時間SOD活性的變化

圖4 不同培養(yǎng)時間POD活性的變化

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Q813.1

A

1673-1409(2012)06-S022-03

2012-05-06

國家自然科學基金項目(30900979)。

蔡小東(1978-)，男，湖北浠水人，博士，副教授，主要從事園藝植物生物技術育種研究。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.06.006