實時熒光PCR檢測兒童肺結核糞便中Mtb-DNA的效果評價

黃慧謙 吳馳 陳建波 楊燕 侯志平 李小勇

2003年WHO估計，每年全球有1～2億人死于結核病，其中有30萬15歲以下兒童死于肺結核。盡管兒童結核病疫情嚴峻，但長期以來，人們往往對成人結核病給予更多的關注，對于兒童結核病卻容易忽視。由于兒童患者痰標本獲得困難，阻礙了小兒結核病的診斷。為了獲得臨床細菌學檢查標本往往需要采用侵入性檢查方法，如采用纖維支氣管鏡（簡稱“纖支鏡”）誘導痰或用胃鏡吸取胃內容物查找抗酸桿菌，這些方法不僅給患兒帶來痛苦，而且也增加了醫院感染的風險，并且敏感度不高。

本研究收集臨床診斷肺結核的住院兒童的糞便標本，同時采用熒光探針加聚合酶鏈反應（PCR）相結合的檢測方法，初步建立起了應用實時熒光PCR（FQ-PCR）技術快速檢測肺結核患兒糞便標本的流程，并對其臨床效果進行初步評估。

材料和方法

一、標本來源與分組

實驗組：收集本院2010年1月至2011年8月間臨床診斷為肺結核并排除腸結核病、年齡小于16歲的住院患兒糞便標本76例作為實驗組，實驗組中41例患兒可取得痰標本進行培養及抗酸桿菌涂片細菌學檢查，進一步分為15例痰菌陽性肺結核患兒、26例痰菌陰性肺結核患兒與35例無痰肺結核患兒3組。住院患者診斷標準符合下列條件之一：痰或纖支鏡刷片查抗酸菌涂片陽性；或Mtb培養陽性；或其他治療無效，影像學檢查符合肺結核病診斷［1］。并正規抗結核治療有效，無腸道結核癥狀與體征，符合肺結核病演變過程。患兒年齡最小1個月，最大16歲，平均年齡（9．91±5．56）歲。其中男性50例，女性26例，男∶女＝1．92∶1。其中臨床診斷為肺結核住院患兒68例，肺結核合并胸膜炎或胸腔積液4例，結核性腦膜炎3例，頸部淋巴結核1例。

對照組：取同時期我院兒科住院的20例其他呼吸系統疾病患兒的糞便標本作為對照組檢測FQ-PCR，其中男性12例，女性8例，男女比例為1．5∶1，年齡最小4個月，最大14歲，平均年齡（8．47±4．03）歲，臨床診斷上呼吸道感染患兒4例，肺炎6例，皰疹性咽峽炎10例。

二、方法

1．糞便標本預處理：新鮮糞便標本收集在無菌塑料杯中，取回實驗室后置入（4℃）冰箱保存，時間不超過48h。取500mg糞便標本加入裝有2ml無菌PBS緩沖液（0．05mol／L，pH 7．4）的試管中充分振蕩搖勻后，3200×g離心5min，收集上清液，重復上述PBS洗滌離心步驟1次，最終收集上清液1ml置于1．5ml的eppendorf管中。然后上清液16 400×g離心10min，棄上清后，沉淀加入1ml生理鹽水中重懸混勻，等分為2份后，16 400×g離心10min，棄上清，保留沉淀，一份標本置于-30℃冰箱中待抽提DNA，另一份標本行涂片檢查。所有標本在1h內預處理完畢。

2．試劑盒抽提DNA：糞便標本預處理后采用進口試劑盒（QIAGEN公司QIAamp DNA mini kit）快速提取DNA，痰標本采用中山大學達安基因股份有限公司提供的Mtb核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒提取DNA，具體操作步驟按照說明書進行。

3．FQ-PCR檢測 Mtb：Mtb核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供。具體操作步驟按照說明書操作。樣本熒光擴增曲線根據說明書進行結果判斷分析。

4．Mtb培養和涂片檢查：痰Mtb培養參照《結核病細菌學檢驗規程》［2］，采用法國梅里埃公司BACTEC MGIT 960快速培養系統，陰性標本培養42d，培養陽性標本需涂片檢查確認。痰、糞便涂片檢查采用金胺O染色，暗視野熒光顯微鏡下檢測，具體操作參照《結核病細菌學檢驗規程》［2］進行。

三、統計學處理

使用SPSS 11．0統計軟件及Excel進行統計分析，兩種方法檢驗結果的比較采用四格表資料分析，計數資料的比較采用卡方檢驗。檢驗水準α＝0．05，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

一、糞便標本FQ-PCR檢測的敏感度和特異度

實驗組76例患兒糞便標本中檢出Mtb-DNA陽性18例，敏感度為23．68%；對照組20例其他呼吸系統疾病患兒的糞便標本進行檢測，FQ-PCR結果均為陰性，特異度為100．00%。

二、糞便標本FQ-PCR與金胺O染色檢測結果的比較

76例患兒糞便標本中，FQ-PCR檢測，Mtb陽性18例，陽性率23．68%（18／76）；76例患兒糞便標本同時采用金胺O染色涂片檢測，Mtb陽性5例，陽性率僅為6．58%（5／76）。兩者均為陽性者5例，兩者均為陰性者58例，涂片陰性、FQ-PCR陽性標本13例，涂片陽性而FQ-PCR陰性標本0例（表1）。FQ-PCR檢測陽性率明顯高于涂片檢測，兩種方法采用四格表資料的Fisher確切概率法計算（累積概率P＝0．00046，P＜0．05），差異有統計學意義。

表1 兩種實驗室檢測方法對糞便標本檢測結果的比較（例）

三、痰細菌學檢測陽性、痰細菌學檢測陰性與無痰肺結核患兒的糞便標本FQ-PCR結果的比較

41例患兒同時進行了至少1次以上的痰標本的涂片和（或）培養檢測（其中痰菌陽性患兒15例、痰菌陰性患兒26例），收集患兒糞便標本進行FQ-PCR檢測；另有35例患兒未收集到痰標本，因此只進行了糞便標本的FQ-PCR檢測。如表2所示，痰菌陽性肺結核患兒組糞便標本FQ-PCR檢測結果陽性10例，陽性率66．67%（10／15）；痰菌陰性肺結核患兒組糞便標本FQ-PCR檢測結果陽性1例，陽性率3．85%（1／26）；無痰肺結核患兒組糞便標本PCR檢測結果陽性7例，陽性率20．00%（7／35）。兩兩比較，痰菌陽性患兒與痰菌陰性患兒（χ2＝16．06，P＜0．05）、無痰肺結核患兒 （χ2＝10．19，P＜0．05）FQ-PCR陽性率，差異有統計學意義；痰菌陰性患兒與無痰肺結核患兒FQ-PCR陽性率比較，差異也有統計學意義（χ2＝8．23，P＜0．05）。

表2 痰菌陽性、痰菌陰性肺結核患兒與無痰肺結核患兒糞便FQ-PCR檢測結果（例）

四、糞便標本與痰標本FQ-PCR檢測結果的比較

41例兒童肺結核患兒同時收集到了糞便和痰標本。取同一患兒的糞便和痰標本進行FQ-PCR檢測，其結果如表3所示，糞便標本PCR檢測結果陽性11例，陽性率26．83%（11／41）；痰標本 PCR檢測結果陽性18例，陽性率43．90%（18／41）；兩者均為陽性有11例，兩者均為陰性有22例，痰標本陰性、糞便PCR陽性標本1例，痰標本陽性而糞便PCR陰性標本8例。兩種方法采用四格表資料χ2檢驗的校正公式進行比較，差異有統計學意義（χ2＝12．93，P＜0．05）。

表3 同一患者的兩種標本FQ-PCR檢測結果比較（例）

討 論

全球結核病疫情發展迅猛，兒童結核病發病率也在增加。長期以來，兒童結核病的診斷與治療容易被忽視，兒童結核病的誤診率極高。國內有文獻統計，超過40%的兒童結核病患者誤診時間大于30d，誤診時間大于90d的患者也不鮮見［3］。兒童結核病診斷較困難最重要的原因之一是，結核病患兒的臨床標本留取困難，細菌學檢查的方法陳舊且陽性率低。2000年我國痰涂片與培養陽性兒童患者不足6萬例，同期據估算全國有活動性肺結核病兒童患者45萬例，即大部分結核病患兒為Mtb細菌學檢查陰性［4］。

兒童和嬰兒無法主動咯出痰標本，本研究實驗組76例兒童肺結核患者中，只有41例患兒最終收集到了痰標本進行涂片和（或）培養檢測。兒童肺結核患者的痰大部分吞入消化道中，據此，國內外有報道通過插胃管吸取胃液標本查分枝桿菌，診斷的陽性率可達20%～40%［5-6］。雖然抽取兒童胃液進行細菌學或PCR檢查，可提高Mtb檢出率，但該方法屬于侵入性操作，既增加了患兒的痛苦又對臨床實施的各方面要求較高，目前在我國難以作為兒童肺結核常規診斷方法，尤其是不適合用于臨床疑似肺結核患兒的初步篩查。2008年，Wolf等［7］對236名懷疑肺結核的患兒進行了大量的侵入性檢查，包括支氣管灌洗和插胃管等，收集到超過2000份臨床標本進行Mtb培養，最終只有16名患兒培養結果為陽性，初篩陽性率極低。

2003年，Montenegro等［8］研究發現肺結核患者糞便標本中可檢測到Mtb-DNA，說明Mtb核酸經過腸道轉運后仍可保持完整。本研究采用試劑盒快速提取糞便樣本中總DNA和FQ-PCR擴增Mtb種屬特異性IS6110核酸片段的方法，最終實驗結果敏感度達到23．68%，特異度為100．00%。本研究中，76例糞便標本FQ-PCR檢測發現陽性18例，陽性率23．68%，金胺O染色涂片檢測陽性標本5例，陽性率僅為6．58%。糞便標本FQ-PCR檢測陽性率明顯高于涂片檢測，該實驗結果與2009年El Khéchine等［9］的相關報道是一致的。一方面說明了糞便標本采用FQ-PCR進行檢測受干擾小，結果靈敏度較高；另一方面，由于Mtb涂片檢查陽性率低于熒光PCR的檢測［10］，同時也由于糞便中雜質較多，導致背景干擾較大，進一步降低了糞便涂片檢查的陽性率，表明糞便標本涂片不適用于臨床查Mtb。

本研究對痰細菌學檢測陽性、痰細菌學檢測陰性與無痰肺結核患兒的糞便標本的FQ-PCR檢測結果進行了比較，還對同一患兒的糞便標本FQPCR檢測結果與痰標本FQ-PCR檢測結果進行了比較。經統計學分析可知，痰菌陽性肺結核患兒糞便標本FQ-PCR陽性率（66．67%）明顯高于痰菌陰性組（3．85%）和無痰患兒組（20．00%）；同一患者的痰標本FQ-PCR檢測陽性率（43．90%）也顯著高于糞便標本PCR檢測陽性率（26．83%），因此，糞便標本PCR檢出率高于糞便涂片但低于痰涂片和（或）培養以及痰PCR，比較敏感。但是，76例結核病患兒中有35例（46．05%）只收集到糞便標本，經FQPCR檢測發現了陽性7例。因此，雖然痰涂片加培養或者痰PCR檢測優于糞便標本PCR檢測，但糞便標本FQ-PCR檢測結果對兒童結核病患者痰標本的細菌學和分子生物學檢測結果是一個有益的補充。

本研究采用試劑盒提取糞便標本中DNA，快速高效，減少了糞便中PCR抑制劑對結果的干擾；采用FQ-PCR擴增技術，比普通PCR擴增加電泳檢查又可大大提高檢測的靈敏度。糞便檢測結果陽性的患兒，不但可避免多次侵入性檢查；而且，整個操作流程只需5～6h，速度遠遠高于Mtb培養所需的幾個星期。同時，保留檢測結果陽性的糞便標本DNA，還可進一步用于利福平、異煙肼等抗結核藥物的耐藥突變位點的檢測。這些研究的證據都表明，糞便標本熒光實時PCR可以協助診斷小兒肺結核病。

總之，糞便熒光實時PCR是一種特異度高、中度敏感、非侵入性且相對安全快速的診斷方法，作為可疑兒童肺結核患者的一項初篩測試，可減少兒童結核病誤診的發生。隨著DNA提取和PCR擴增技術的不斷改進，其檢測陽性率還可進一步提高。由于結果的高特異度，早期糞便熒光實時PCR檢測還能幫助臨床醫生迅速找出肺結核患兒，并開始進行早期治療。

［1］金彪，朱銘．兒童胸部影像學診斷．第9講 兒童肺結核的影像診斷．中國實用兒科雜志，2004，19（9）：574-575．

［2］中國防癆協會基礎專業委員會．結核病診斷實驗室檢驗規程．北京：中國教育文化出版社，2006．

［3］紀洪新，邱建清，周峰．兒童結核病延誤診斷原因分析．臨床肺科雜志，2005，10（2）：238．

［4］中華人民共和國衛生部．2000年第四次全國肺結核病流行病學抽樣調查．北京：人民衛生出版社，2003：1-52．

［5］Smith KC，Starke JR，Eisenach K，et al．Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens from children using a polymerase chain reaction．An Pediatrics，1996，97（2）：155-160．

［6］肖愛清，侯雙翼，王文，等．聚合酶鏈反應技術檢測兒童肺結核效果初探．中國熱帶醫學，2003，3（2）：140-141．

［7］Wolf H，Mendez M，Gilman RH，et al．Diagnosis of pediatric pulmonary tuberculosis by stool PCR．Am J Trop Med Hyg，2008，79（6）：893-898．

［8］Montenegro SH，Gilman RH，Sheen P，et al．Improved detection of Mycobacterium tuberculosis in Peruvian children by use of a heminested IS6110polymerase chain reaction assay．Clin Infect Dis，2003，36（1）：16-23．

［9］El Khéchine A，Henry M，Raoult D，et al．Detection of Mycobacterium tuberculosis complex organisms in the stools of patients with pulmonary tuberculosis．Microbiology，2009，155（Pt 7）：2384-2389．

［10］吳馳，張紅梅，詹能勇，等．熒光定量PCR技術在肺結核診斷中的臨床應用研究．中國防癆雜志，2010，32（10）：647-650．