茶多酚含量測定方法研究綜述

黨法斌，高 峰，郭 磊，韓曉弟

（山東大學(xué)威海分校海洋學(xué)院，山東威海264209）

茶多酚含量測定方法研究綜述

黨法斌，高 峰，郭 磊，韓曉弟*

（山東大學(xué)威海分校海洋學(xué)院，山東威海264209）

近年來，茶多酚因其獨特的藥理性質(zhì)受到越來越廣泛的重視，然而茶多酚因其成分復(fù)雜，準(zhǔn)確測定困難，嚴(yán)重制約著對茶多酚功能的進一步研究。綜述了近年來國內(nèi)外對茶多酚含量測定方法的研究進展，詳細(xì)敘述了酒石酸亞鐵分光光度法、原子吸收法、近紅外光譜法、高效液相色譜法等研究方法，以期對今后相關(guān)研究提供參考。

茶多酚，含量，測定方法

茶屬雙子葉植物，約30屬，500種，主要分布在亞洲和非洲，其次在美洲、大洋洲和歐洲也有分布，是世界上消費最廣的飲料。經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)的分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)茶葉中含有機化學(xué)成分達四百五十多種，無機礦物元素達四十多種。其中有機化學(xué)成分和無機礦物元素含有許多營養(yǎng)成分和藥效成分。越來越多的證據(jù)表明，從茶葉中提取的茶多酚在增強人體健康方面具有重要的作用。近年來，茶多酚因其獨特的藥理性質(zhì)受到越來越廣泛的重視[1]，許多體內(nèi)和體外研究都表明茶多酚可能在預(yù)防癌癥[2-4]、慢性胃炎[5-6]、神經(jīng)退化[7]和心血管疾病[8-9]中具有重要作用。對茶多酚與癌癥化學(xué)防御的分子機制的研究表明：調(diào)控細(xì)胞增殖的細(xì)胞外信號被茶多酚通過控制EFG受體的下調(diào)而抑制[10-11]。茶多酚是茶葉中酚類及其衍生物的總稱，主要包括兒茶素類、黃酮及黃酮醇類、花色素類、酚酸及縮酚酸類等四大類物質(zhì)。茶多酚是一系列化合物的混合物，目前經(jīng)分離鑒定的化合物就達400多種，而不同地區(qū)茶葉樣品中這些化合物的含量和種類亦各不相同，因此在測定某種茶葉中茶多酚含量時往往需要找到一種標(biāo)準(zhǔn)對照樣品，若以每種純組分為對照來分別測定各種組分的含量，會使工作量大大增加且不切實際。因此，建立一種簡單、高效、準(zhǔn)確的測定茶多酚相對含量的方法對促進茶多酚的研究具有重要的實際意義。本文綜述了近年來國內(nèi)外茶多酚含量測定方法的研究進展，以期對相關(guān)研究提供參考。

1 茶多酚含量測定方法

1.1 酒石酸亞鐵分光光度法

茶多酚主要成分為兒茶素類和沒食子兒茶素類（母體結(jié)構(gòu)見圖1[12]），而沒食子酸丙酯（結(jié)構(gòu)見圖2）與兒茶素類在結(jié)構(gòu)上具有相同的特點，既具有鄰位酚性羥基和連位酚性羥基，又具有羥丙酯基。酒石酸亞鐵主要是與茶多酚中的鄰位羥基和連位羥基功能團發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)特定的顏色反應(yīng)，而對間位羥基和單羥基不顯色。

根據(jù)該原理：茶多酚（mg/mL）=E×1.5。

式中：E—根據(jù)試樣測得的吸光度（A），從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的沒食子酸乙酯相應(yīng)含量，mg/mL；1.5—茶多酚含量的換算系數(shù)，即1mg沒食子酸丙酯的吸光值相當(dāng)于1.5mg茶多酚吸光值。

王麗珠[13]等采用沒食子酸丙酯作為基準(zhǔn)物，酒石酸亞鐵作為顯色劑，利用分光光度法在540nm波長下測定茶多酚含量，其研究結(jié)果表明：當(dāng)溶液pH在7.5時，茶多酚與酒石酸亞鐵能形成穩(wěn)定的藍紫色或紅紫色絡(luò)合物，并且酒石酸亞鐵的加入量為4.0～6.0mL時，吸光值最大且穩(wěn)定。

目前國標(biāo)GB/T 21733－2008中也采用酒石酸亞鐵比色法對茶多酚含量進行測定，但杜淑霞[14]等在實驗中發(fā)現(xiàn)，該方法對奶茶類飲料樣品的預(yù)處理存在一定的缺陷，按標(biāo)準(zhǔn)方法處理樣品，得到的樣液渾濁，從而影響了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，不適合渾濁且成分復(fù)雜的奶茶樣品中茶多酚含量的測定，通過改進樣品的處理方法，可以克服上述缺陷。

其研究表明：加入適量的鹽酸后，能夠促進丙酮破乳和沉淀蛋白質(zhì)，從而可以提高奶茶飲料中茶多酚含量測定的精密度和準(zhǔn)確度，但因為茶多酚在pH4～8之間穩(wěn)定，因此加入鹽酸量過多，會降低茶多酚的測定結(jié)果。該實驗結(jié)果表明，在樣品澄清過程中加入0.50mL 1%鹽酸較合適。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)：樣品處理靜置時間在30min后，茶多酚含量趨于穩(wěn)定；比色測定放置時間在60min內(nèi)，絡(luò)合物較為穩(wěn)定，而在60min以后，吸光度開始下降。

此外，因為在茶多酚母體結(jié)構(gòu)中有一個苯環(huán)的鄰位含有2個羥基，因此具有還原性，可將Fe3+還原為Fe2+，而Fe2+可與鄰二氮菲發(fā)生反應(yīng)生成橘紅色的絡(luò)合物，該絡(luò)合物在509nm處具有最大吸光值，從而可通過測定該絡(luò)合物的吸光度來間接測定樣品中的茶多酚含量。

圖1 茶多酚的母體結(jié)構(gòu)Fig.1 Tea polyphenols maternal structure

圖2 沒食子酸丙酯Fig.2 Propyl gallate

1.2 原子吸收法

在中性介質(zhì)中，茶多酚也能與Pb2+發(fā)生沉淀反應(yīng)生成難溶的黃色沉淀[15]，因此可在茶葉樣品液中加入過量的Pb2+，通過原子吸收法測定上清液中Pb2+的濃度，從而得到一種間接測定茶多酚的方法。根據(jù)上述原理，雷存喜等[16]分別用分光光度法和間接原子吸收光譜法測定了黑茶樣品中茶多酚的含量。其研究結(jié)果表明：兩種測定方法之間具有良好的相關(guān)性，且具有簡便、快速、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于茶葉中茶多酚含量測定。

廖曉玲等[17]用堿式乙酸鉛作絡(luò)合沉淀劑，通過原子吸收法測定上清液中Pb2+的濃度，其研究發(fā)現(xiàn)測定時儀器最佳條件為：波長217nm，通帶寬度0.4nm，燈電流為3.0mA，燃燒器高度為5.0nm。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)：當(dāng)反應(yīng)溫度在90℃以上，反應(yīng)時間為20min，溶液pH在5～8范圍內(nèi)，加入堿式乙酸鉛濃度為1mg/mL且加入量為1mL時，吸光值較為穩(wěn)定。研究結(jié)果表明：茶多酚濃度在3～25μg/mL范圍內(nèi)時完全符合Beer定律，具有靈敏度高、簡單、快速的優(yōu)點，可方便地用于食品添加劑中微量茶多酚含量的測定。

1.3 近紅外光譜法

近紅外光譜技術(shù)是一種弱光譜分析技術(shù)，經(jīng)過半個世紀(jì)的發(fā)展，現(xiàn)代近紅外光譜分析無論在理論上、技術(shù)上和應(yīng)用上都取得了長足的發(fā)展，目前已趨向成熟。與傳統(tǒng)的分析方法相比，近紅外光譜技術(shù)分析樣品具有方便、快速、高效、準(zhǔn)確和成本較低、不破壞樣品、不消耗化學(xué)試劑、不污染環(huán)境等優(yōu)點，目前在作品物質(zhì)分析、面粉加工業(yè)、煙草與紡織行業(yè)、食品分析、石油化工業(yè)分析、制藥行業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、過程分析等領(lǐng)域中取得了廣泛的應(yīng)用[18]。

其主要原理是：近紅外光譜區(qū)（780～2526nm）[19]與有機分子中含氫基團（OH、NH、CH）振動的合頻和各級倍頻的吸收區(qū)一致，通過掃描樣品的近紅外光譜，可以得到樣品中有機分子含氫基團的特征信息，NIR光譜主要是反映C－H、O－H、N－H、S－H等化學(xué)鍵的信息，幾乎可覆蓋所有的有機化合物和混合物。

Quansheng Chen等[20]比較了利用不同的算法（PLS、iPLS和siPLS）建立數(shù)學(xué)模型來測定綠茶中總多酚的含量，其研究結(jié)果表明，與另外兩種算法相比，用siPLS算法建立數(shù)學(xué)模型可以更好地測定綠茶中總多酚的含量。

SiPLS（synergy interval partial least squares）是Norgaard等提出的[21]，建立在IPLS基礎(chǔ)上的一種波長選擇算法，是IPLS的一個擴展。通過不同波長區(qū)間個數(shù)的任意組合，得到相關(guān)系數(shù)最大且誤差最小的波長區(qū)間組合。其原理與IPLS相同，首先將NIR全譜分割成等長的n個波長區(qū)間，在每個子區(qū)間上進行PLS回歸，建立待測組分的局部回歸模型，得到n個局部回歸模型。以交互驗證均方根（RMSECV）和預(yù)測均方根（RMSEP）為各模型的精度衡量指標(biāo)，通過比較全光譜模型和各局部模型的精度，取精度最高的局部模型所在的子區(qū)間為建模波長區(qū)間，然后再以該波長區(qū)間為中心單向或雙向擴充（或消減）波長變量，得到最佳的波長區(qū)間。

Quansheng Chen等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將光譜區(qū)分成23個區(qū)間和5個PLS組分時（表1），得到了用siPLS算法建立的最優(yōu)數(shù)學(xué)模型，并由此得出測量綠茶中總多酚含量的最佳波長區(qū)間為7791.01～7960.71、7964.57～8134.27、8658.82～8828.52cm－1。

王毅等[22]利用小波消噪預(yù)處理茶葉近紅外光譜，濾去其中的噪聲信息，再用區(qū)間偏最小二乘法（iPLS）與遺傳算法（GA）相結(jié)合的PLS波長篩選法iPLS－GA建立茶多酚的預(yù)測模型，即通過iPLS定位出若干信息區(qū)間，再用GA通過全局優(yōu)化，從中選出波長點，最終共有18個波數(shù)點用于建立茶多酚模型，建模數(shù)據(jù)量大為減少。

其研究表明：經(jīng)小波消噪和iPLS-GA處理所得茶葉近紅外光譜模型最佳，模型在6158～6000cm-1和4717～4559cm-1區(qū)間中建立，校正時其相關(guān)系數(shù)Rc和交互驗證均方根誤差RMSECV分別為0.9648和2.14，預(yù)測時的相關(guān)系數(shù)Rp和預(yù)測均方根誤差RMSEP分別為0.9587和2.22，均比其它模型好。

表1 siPLS校正模型選擇不同的光譜區(qū)間時的結(jié)果Table 1 Results of siPLS calibration model selected different spectral regions

1.4 高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）

高效液相色譜法（HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。20世紀(jì)60年代后期，已經(jīng)發(fā)展得比較成熟的氣相色譜的理論與技術(shù)開始應(yīng)用于液相色譜，使液相色譜得到了迅速的發(fā)展。目前，高效液相色譜法因其高效、高靈敏度、分析速度快的特點而得到廣泛的應(yīng)用。

1974年，美國AC Hoefler等[23]提出用HPLC法測定茶葉中多酚物質(zhì)，配合使用反向鍵合填充劑，可將茶葉提取液直接注入色譜柱，30min之內(nèi)就達到了理想的分離，配以紫外檢測器就能迅速、準(zhǔn)確地測定出多酚物質(zhì)的含量。

張小紅等[24]采用HPLC法，以Alltima phenyl柱（4.6mm×250mm，5μm）為色譜柱，以甲醇∶水∶磷酸（21∶78.9∶0.1）為流動相，流速1.0mL·min-1，在波長278nm處測定綠茶雪哈片中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量。研究表明：表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）在0.6048～3.024μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。此外，該實驗中通過比較不同的色譜柱和流動相，發(fā)現(xiàn)采用Alltima苯基柱和等度洗脫的方法可以達到快速分離EGCG的目的，并且因為EGCG中含大量的酚羥基，所以在流動相中加入少量的酸可以抑制酚羥基與硅醇基結(jié)合，以防止在洗脫時產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。

劉錦文等[25]以DiamonsilC18（4.6mm×200mm，5μm）為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸水溶液（68∶32）為流動相，進樣量20μL，柱溫25℃，流速10mL·min-1的條件下，發(fā)現(xiàn)茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）在20min內(nèi)出現(xiàn)峰值，并且以279nm為吸收波長，EGCG進樣量在0.1～0.6μg，ECG進樣量在0.05～1.2μg范圍內(nèi)時，進樣量與峰面積具有良好的線性關(guān)系，重復(fù)性實驗和穩(wěn)定性實驗發(fā)現(xiàn)該法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)語

20世紀(jì)80年代以來，茶多酚因其抗氧化作用和良好的藥理作用，高效的抗癌、抗衰老、抗輻射、清除人體自由基、降血糖和血脂、治心血管病、抑菌抑酶等作用，在食品工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和日用化工中得到廣泛應(yīng)用。根據(jù)GB/T8313－2008和GB/T8313-2002所測數(shù)據(jù)之間存在很大的差異[26]，雖然目前國內(nèi)外對茶多酚含量測定方法的研究已有很多，但茶多酚因其成分復(fù)雜，不同的測定方法之間存在較大差異且多穩(wěn)定性、重復(fù)性較差，因此準(zhǔn)確測定困難，嚴(yán)重制約著對茶多酚功能、機制的進一步研究。因此，發(fā)現(xiàn)一種高效、準(zhǔn)確、綠色、穩(wěn)定的含量測定方法對茶多酚的深入研究具有重要意義。

[1]Yang CS，Pius Maliakal，Meng XF.Inhibition of carcinogenesis by tea[J].Pharmacology and Toxicology，2002，42：25-54.

[2]Yang GY，Liao J，K Kim，et al.Inhibition of growth and induction of apoptosis in human cancer cell lines by tea polyphenols[J].Carcinogenesis，1998，19（4）：611-616.

[3]Hasan Mukhtar，Nihal Ahmad.Tea polyphenols：prevention of cancer and optimizing health[J].The American Journal of Clinical Nutrition，2000，71（6）：1698-1702.

[4]Gary D，Stoner，Hasan Mukhtar.Polyphenols as cancer chemopreventive agents[J].Journal of Cellular Biochemistry，1995，59（22）：169-180.

[5]VW Setianwan，Zhang ZF，Yu GP，et al.Protective effect of green tea on the risks of chronic gastritis and stomach cancer[J]. International Journal of Cancer，2001，92（4）：600-604.

[6]JH Weisburger，F(xiàn)ung-Lung，Chung.Mechanisms of chronic disease causation by nutritional factors and tobacco products and their prevention by tea polyphenols[J].Food and Chemical Toxicology，2002，40（8）：1145-1154.

[7]Silvia Mandel，Orly Weinreb，Tamar Amit，et al.Cell signaling pathways in the neuroprotective actions of the green tea polyphenol（-）-epigallocatechin-3-gallate：implications for neurodegenerative diseases[J].Neurochemistry，2004，88（6）：1555-1569.

[8]Naghma Khan，Hasan Mukhtar.Tea polyphenols for health promotion[J].Life Science，2006，545（1）：51-64.

[9]Kei Nakachi，Satoru Matsuyama，Satoshi Miyake，et al. Preventive effects ofdrinking green tea on cancerand cardiovascular disease：Epidemiological evidence for multiple targeting prevention[J].BioFactors，2000，13（14）：49-54.

[10]YC Liang，YC Chen，YL Lin，et al.Suppression of extracellular signals and cell proliferation by the black tea polyphenol， theaflavin-3，3′-digallate[J].Carcinogenesis，1999，20（4）：733-736.

[11]YC Liang，Shoei-Yn Lin-Shiau，CF Chen，et al.Inhibition of cyclin-dependent kinases 2 and 4 activities as well as induction of cdk inhibitors p21 and p27 during growth arrest of human breast carcinoma cells by（-）-epigallocatechin-3-gallate[J]. Journal of Biochemistry，1999，75（1）：1-12.

[12]徐文峰，廖曉玲.茶葉中茶多酚的分析測定方法研究現(xiàn)狀[J].重慶文理學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，27（2）：52-55.

[13]王麗珠，吳棱，姚元根，等.酒石酸亞鐵分光光度法測定茶多酚[J].光譜實驗室，1997，14（3）：52-54.

[14]杜淑霞，歐仕益，徐麗，等.奶茶中多酚含量測定方法的改進[J].食品工業(yè)科技，2010，31（4）：358-361.

[15]李志南，姚紅，肖純.茶多酚與Pb2+絡(luò)合反應(yīng)機理及應(yīng)用研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，1997，10（2）：85-89.

[16]雷存喜，吳德燕.益陽黑茶中茶多酚含量測定研究[J].湖南城市學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，18（4）：45-47.

[17]廖曉玲，王會玲，徐凱明，等.茶多酚含量測定方法的研究[J].中國油脂，2002，27（1）：68-69.

[18]嚴(yán)衍祿，趙龍蓮.近紅外光譜分析基礎(chǔ)與應(yīng)用[M].北京：輕工業(yè)出版社，2005.

[19]Stark E，Luchter K，Margoshes M.Near-infrared analysis（NIRA）：a technology for quantitative and qualitative analysis[J]. Appl Spectrosc Rev，1986，22（4）：335-399.

[20]Chen QS，Zhao JW，Liu MH，et al.Determination of total polyphenols content in green tea using FT-NIR spectroscopy and different PLS algorithms[J].Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2008，46（3）：568-573.

[21]L Norgaard，A Saudland，J Wagner，et al.Internal partial least-squares regression（iPLS）：a comparative chemometric study with an example from near-infrared spectroscopy[J].Applied Spectroscopy，2000，54（3）：413-419.

[22]王毅，陳斌，葉靜，等.優(yōu)化茶多酚近紅外光譜定量分析模型[J].計算機與應(yīng)用化學(xué)，2010，27（5）：686-690.

[23]AC Hoefler，P Coggon.Reversed-phase high-performance liquid chromatography of tea constituents[J].Chromatography A，1976，129：460-463.

[24]張小紅，雷曉林，錢星文.HPLC法測定綠茶雪哈片中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量[J].安徽醫(yī)藥，2010，14（8）：899-901.

[25]劉錦文，李紅玉，石瑞君，等.高效液相色譜法測定茶多酚中EGCG和ECG的含量[J].食品工業(yè)科技，2010，31（11）：372-374.

[26]黃皓，毛志方，涂云飛，等.兩種方法測定茶葉中茶多酚含量的比較[J].中國茶葉加工，2009（2）：43-44.

Research status of determination method of tea polyphenol content

DANG Fa-bin，GAO Feng，GUO Lei，HAN Xiao-di*
（Marine College，Shandong University at Weihai，Weihai 264209，China）

In recent years，tea polyphenol because of its unique pharmacological nature are getting more and more extensive attention，however，the complex of composition and difficulty of accurately determination constrain the further study of tea polyphenols’function.The content determination method research progress of tea polyphenols of domestic and foreign in recent years was reviewed，the ferrous tartaric acid spectrophotometric method，atomic absorption method，the near infrared spectra method and HPLC method were narrated，so as to provide a reference for future studies.

tea polyphenols；content；determination method

TS207.3

A

1002-0306（2012）05-0410-04

2011－03－31 *通訊聯(lián)系人

黨法斌（1989-），男，在讀本科生，研究方向：生物技術(shù)。

山東大學(xué)威海分校科研立項資助項目（SRTPA10038）。