裂褶菌產(chǎn)內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化研究

暢曉潔，鄭必勝，趙 欣

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

裂褶菌產(chǎn)內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化研究

暢曉潔，鄭必勝*，趙 欣

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

采用恒溫?fù)u床培養(yǎng)法培養(yǎng)裂褶菌，研究了裂褶菌產(chǎn)內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶培養(yǎng)基組成中的碳源、氮源及各種無機鹽的單因素參數(shù)，并采用四因素三水平正交實驗對主要影響因素進(jìn)行分析，從而確定最佳的產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為：葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%。

裂褶菌，內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶，培養(yǎng)基組成

裂褶多糖（Schizophylluan，簡稱SPG）是由藥用真菌裂褶菌分泌的一種中性胞外多糖，且只含有β-D-葡聚糖[1]。獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使得它在調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等方面有著顯著的療效。但天然裂褶多糖分子量大，在水中溶解度小、粘度大，若將未經(jīng)降解處理的裂褶多糖用于注射治療腫瘤疾病，會引發(fā)肌肉疼痛、血栓等問題[2]。日本學(xué)者提出在提取天然裂褶多糖時必須獲得有效的“活性多糖”，即在提取過程就要對多糖進(jìn)行降解或者改性[3]。研究表明，裂褶菌可產(chǎn)生胞外內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶[3]，在內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的作用下，多聚糖苷鍵斷裂，葡聚糖水解為寡糖或還原糖，即通過酶切來降低β-D-葡聚糖的聚合度而不改變其天然結(jié)構(gòu)，不影響或降低其生物活性[4-5]。本文對裂褶菌產(chǎn)內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的培養(yǎng)基組成，為提高裂褶菌產(chǎn)的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶活力提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.） 廣東省微生物研究所；斜面種子培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；蛋白胨、酵母膏、牛肉膏 廣東環(huán)凱生物科技公司，生化試劑；葡萄糖 分析純，上海博奧生物科技有限公司；冰醋酸、NaAC、無水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、NaOH 分析純，天津化學(xué)試劑廠；MgSO4·7H2O、KH2PO4·2H2O、尿素、NH4Cl、NH4NO3、NH4SO4、NH4H2PO4分析純，廣州市東紅化工廠；苯酚、3，5-二硝基水楊酸 分析純，汕頭市光華化學(xué)廠；裂褶多糖 本實驗室制備。

pHS-3C型pH計 上海虹益儀器；HQ45B氣浴恒溫?fù)u床 中科院武漢科儀廠；HSP150生化培養(yǎng)箱 武漢中科儀有限公司；UV-2102PC紫外可見光分光光度計 上海UNICO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨0.3%，硝酸銨0.25%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，pH7.0，121℃滅菌15min。發(fā)酵培養(yǎng)基：配制12°Brix麥芽汁1000mL，稱取1.0g/L NH4Cl溶于其中，121℃滅菌15min[6]。

1.2.2 培養(yǎng)方法 從28℃下培養(yǎng)6d的斜面種子培養(yǎng)基上用接種環(huán)小心刮下孢子，用10mL無菌水洗入預(yù)先滅菌的裝有30mL無菌水的帶玻璃珠三角瓶中，置于搖床上振蕩30min，即得到單孢子懸液（孢子濃度為106/mL）。

將單孢子懸液接種于100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30℃，160r/min搖床上控溫發(fā)酵，發(fā)酵7d后測定酶活力。

1.2.3 酶活力測定方法 以裂褶多糖為底物，采用應(yīng)用最廣泛的還原糖法測定β-1，3-葡聚糖酶活力。

1.2.3.1 DNS試劑的配制[7]稱取10g 3，5-二硝基水楊酸于水中，全部溶解后，加入20g NaOH、200g酒石酸鉀鈉，加入蒸餾水，使總體積至500mL左右，加熱溶解后，加2g苯酚、0.5g無水亞硫酸鈉，加熱攪拌至全部溶解，冷卻，用水稀釋至1000mL，儲于棕色瓶中。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取葡萄糖100mg，用適量蒸餾水溶解并定容于100mL容量瓶中。分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL葡萄糖液，各加水至1.0mL，加入DNS溶液1.5mL，沸水浴5min顯色。冷卻后用蒸餾水定容至25mL，搖勻，在520nm條件下測定吸光值，取1.5mL蒸餾水代替DNS溶液作為空白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 裂褶菌產(chǎn)內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶活力的測定 1mL NaAC-HAC緩沖液（0.05mol/L，pH5.0）、1mL酶液、1mL 0.5%裂褶多糖組成反應(yīng)體系，于50℃水浴振蕩反應(yīng)30min，沸水浴5min滅酶活，取上清液1mL用還原糖法測定酶水解液中的還原糖量（以葡萄糖計），以滅活酶作空白。

酶活力單位：在上述反應(yīng)條件下，1min水解β-1，3-葡聚糖釋放出1μmol葡萄糖所需的酶量，即為一個酶活力單位，以U表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 還原糖法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of reduced sugars

2.2 內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶活力的測定

初步設(shè)計的裂褶菌搖瓶發(fā)酵初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基，測得其發(fā)酵液酶活U為3.52u/mL，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化研究。

2.2.1 葡萄糖添加量對產(chǎn)酶的影響 研究表明：裂褶菌利用葡萄糖的能力高于二糖和三糖，在培養(yǎng)基中添加少量葡萄糖能夠大幅度地提高產(chǎn)酶量[4]。葡萄糖的起始添加量對產(chǎn)酶影響很大，當(dāng)添加量過低時，裂褶菌提前發(fā)生自溶現(xiàn)象；但添加量過高，酶會受到分解代謝阻遏。

圖2 葡萄糖添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of glucose additioin on enzyme activity

分別以0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%不同添加量的葡萄糖作為碳源，研究葡萄糖的添加量對產(chǎn)酶的影響。從圖2可知，在葡萄糖添加量較低時，發(fā)酵液酶活U隨著葡萄糖添加量的增大而增大，當(dāng)葡萄糖的添加量較高時，發(fā)酵液酶活U大幅度下降，說明酶受降解物阻遏明顯；最適葡萄糖添加量為1.5%。

2.2.2 不同有機氮源對產(chǎn)酶的影響 分別以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素作為有機氮源，在初始產(chǎn)酶條件下進(jìn)行發(fā)酵，研究等量的不同有機氮源對β-1，3-葡聚糖酶產(chǎn)量的影響。

圖3 不同有機氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of different organic nitrogenous on enzyme activity

由圖3可知，以牛肉膏為唯一有機氮源的培養(yǎng)基所產(chǎn)的β-1，3-葡聚糖酶活力最高；其次是酵母膏。由于酵母膏和牛肉膏成分復(fù)雜，可能含有微生物生長需要的生長因子，從而促進(jìn)了產(chǎn)酶。以尿素為唯一有機氮源的培養(yǎng)基中裂褶菌生長不好，測不到酶活力。可能是因為經(jīng)過高溫滅菌和發(fā)酵，尿素中的營養(yǎng)成分早已損失殆盡，或是因為裂褶菌屬于木腐菌，尿素加入到培養(yǎng)基中不但在高溫下會分解出游離氨，而且在菌絲生長后也會被菌絲的代謝物降解出游離氨，當(dāng)培養(yǎng)基不能吸收氨態(tài)氮時，氨便以氣態(tài)方式存在，當(dāng)培養(yǎng)基中氨過高時，菌絲便會停止生長至死亡[8]。因此，最佳有機氮源為牛肉膏。

2.2.3 不同無機氮源對產(chǎn)酶的影響 確定葡萄糖的添加量和最佳有機氮源后，對無機氮源進(jìn)行單因素實驗。分別以NH4Cl、NH4NO3、NH4SO4、NH4H2PO4作為無機氮源，添加量以氮元素摩爾數(shù)相等為依據(jù)，在初始產(chǎn)酶條件下進(jìn)行發(fā)酵。

由圖4可知，不同無機氮源產(chǎn)酶活力大小順序為：NH4Cl＞NH4NO3＞NH4H2PO4＞（NH4）2SO4。使用（NH4）2SO4、NH4H2PO4和NH4NO3作無機氮源時，裂褶菌生長不好，酶活也不高。可能是由于NH4+被利用后剩余的NO3-、SO42-和H2PO4-使培養(yǎng)基呈酸性，菌絲雖能利用但生長緩慢。用NH4Cl作無機氮源時，對生長和產(chǎn)酶都有明顯的促進(jìn)作用。因此，NH4Cl是最佳無機氮源。

圖4 不同無機氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of different inorganic nitrogenous on enzyme activity

2.2.4 MgSO4對產(chǎn)酶的影響 Mg2+是金屬離子中較為重要的一種，它是許多酶活性中心不可缺少的一部分[9]。分別以MgSO4添加量為0.02%、0.05%、0.1%和0.15%在初始條件下進(jìn)行發(fā)酵。

由圖5可知，改變MgSO4的添加量對裂褶菌產(chǎn)內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的影響并不顯著，當(dāng)MgSO4添加量為0.05%時，內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶活力略高，因此，MgSO4最適添加量為0.05%。

圖5 MgSO4添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of MgSO4on enzyme activity

2.2.5 KH2PO4對產(chǎn)酶的影響 磷酸鹽不僅是核酸、酶和能量代謝的組成部分，也是菌絲生長中必不可少的元素。當(dāng)缺乏磷源時，碳源和氮源也不能被很好地利用[10]。因此，磷酸鹽的濃度對裂褶菌的生長和內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的產(chǎn)生有著較大的影響。

分別以KH2PO4添加量為0.02%、0.05%、0.1%和0.15%在初始條件下進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見圖6。

圖6 KH2PO4添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of KH2PO4on enzyme activity

從圖6可知，KH2PO4的濃度對內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶產(chǎn)酶水平的影響表現(xiàn)出最適濃度效應(yīng)。低濃度的KH2PO4有利于內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的產(chǎn)生，內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的產(chǎn)酶水平隨著KH2PO4濃度的增加而升高；當(dāng)KH2PO4濃度達(dá)一定值后繼續(xù)升高時，內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶活性反而降低。因此，KH2PO4最適添加量為0.05%。

2.3 正交實驗

在確定了最佳碳源和最佳氮源（包括有機氮源和無機氮源）基礎(chǔ)上，對葡萄糖、牛肉膏和NH4Cl采用正交法設(shè)計實驗，選用四因素三水平正交實驗表L9（34）（見表2）以確定最佳培養(yǎng)基配方。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交實驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

根據(jù)表2結(jié)果可知，三因素對產(chǎn)酶影響的主次順序為：葡萄糖＞牛肉膏＞NH4Cl。同時比較同一因素在不同水平下所對應(yīng)酶活的大小，從而得到的各個因素的最優(yōu)水平組合為A3B2C1，即這三個因素的添加量為葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%。

采用實驗所得的最佳培養(yǎng)基配方，即葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%，經(jīng)過三次平行實驗得到的酶活U分別為12.13、13.17、11.48u/mL，說明該菌株在上述培養(yǎng)基組合下產(chǎn)酶較穩(wěn)定。由此確定以上優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方。

3 結(jié)論

3.1 不同有機氮源在一定程度上均能促進(jìn)酶的合成，以牛肉膏為最佳。

3.2 添加以相同摩爾數(shù)氮元素的不同無機氮源時，NH4Cl是最佳無機氮源。

3.3 MgSO4和KH2PO4對產(chǎn)酶的影響都不是很大，MgSO4和KH2PO4添加量均為0.05%時，產(chǎn)酶效果最好。

3.4 正交實驗中以葡萄糖、牛肉膏和NH4Cl作為優(yōu)化菌株產(chǎn)內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的實驗因素，發(fā)現(xiàn)對產(chǎn)酶的影響主次因素是：葡萄糖gt;牛肉膏gt;NH4Cl，從而得到裂褶菌產(chǎn)內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%。

[1]李兆蘭.裂褶多糖的結(jié)構(gòu)研究[J].南京大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1994，30（3）：482-486.

[2]Kikumoto S，Yamamoto O，Komatsu N.Method of produing neoschizophyllan having novel pharmacological activity[J].United States Patent，1978（4）：661.

[3]Prokop A，Rapp P，wanger F.Production purification and characterization of an extracellular endo-β-1，3-glucanase from amonokaryon of schizophyllum commune ATCC 38548 defective in exo-β-1，3-glucanase formation[J].Can J Microbiol，1995，40：18-23.

[4]Chernin L，Chet I.Microbial enzymes in the biocontrol of plant pathogens and pests.In：Dick R P and Burns R G eds.，Enzyme in the Environment[J].New Youk：Marcel Dekker，2002： 171-225.

[5]Chet I，Chernin L.Biocontrol，microbiol agents in soil// Bitton G ed，Encyclopedia of environmental microbiology[J].New York：John Willey and Son Inc，2002：450-465.

[6]鄭文科，喬長晟，郝利民，等.四種生長因子對裂褶菌胞外多糖產(chǎn)量影響的優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30（5）：181-183，187.

[7]張龍翔.生化實驗方法和技術(shù)[M].北京：人民教育出版社，1982.

[8]Jianguang Luo，Jun Liu，Chunling Ke.Optimization of medium composition forthe production ofexopolysaccharidesfrom Phellinus baumii Pilát in submerged culture and the immunostimulating activity of exopolysaccharides[J].Carbohydrate Polymers，2009，78（3）：409-415.

[9]Katarína Kolenová， Mária Vr?anská.Purification and characterization of two minor endo-β-1，4-xylanases of Schizophyllum commune[J].Enzyme and Microbial Technology，2005，36（7）：903-910.

[10]S G Jonathan，I O Fasidi.Studies on phytohormones，vitamins and mineral element requirements of Lentinus subnudus（Berk）and schizophyllum commune（Fr.Ex.Fr）from Nigeria[J].Food Chemistry，2001，75（3）：303-307.

Study on the optimization of medium composition of endo-β-1，3-glucanase producing by Schizophyllum commune Fr.

CHANG Xiao-jie，ZHENG Bi-sheng*，ZHAO Xin
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The constant shaking was used to culture Schizophyllum commune Fr.，and the different single-factor parameters of carbon，nitrogen and various salt forming the medium of endo-β-1，3-glucanase producing by Schizophyllum commune Fr.was studied.At the same time，the four factors and three level orthogonal experimental was used to analyze the main factor.Finally，determining the optimum medium composition：glucose 2%，beef extract 0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%.

Schizophyllum commune Fr.；endo-β-1，3-glucanase；medium composition

TS201.3

A

1002-0306（2012）05-0167-04

2011－03－09 *通訊聯(lián)系人

暢曉潔（1987-），女，碩士生，研究方向：糖類分離提純新方法新技術(shù)。