一株槐樹(shù)內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)羥自由基所致小鼠肝組織過(guò)氧化的體外作用

史佳琴，陳 強(qiáng)，王梅霞，陳雙林

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210046）

一株槐樹(shù)內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)羥自由基所致小鼠肝組織過(guò)氧化的體外作用

史佳琴，陳 強(qiáng)，王梅霞，陳雙林*

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210046）

為了研究初篩獲得的具有較高抗氧化活性和清除O2-·能力的槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物對(duì)·OH導(dǎo)致的氧化損傷的抑制作用及其清除·OH的效果，采用Fe2+-H2O2和Fe2+-VC兩種羥自由基發(fā)生系統(tǒng)，以硫代巴比妥酸法測(cè)定了小鼠肝勻漿及肝線粒體中脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛（MDA）含量，以分光光度法測(cè)定了小鼠肝線粒體的膨脹程度。結(jié)果表明，槐樹(shù)內(nèi)生真菌No.7發(fā)酵液提取物具有清除·OH的作用，能抑制小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化，從而降低線粒體氧化損傷及腫脹。

槐樹(shù)，內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物，羥自由基，抗氧化

植物內(nèi)生真菌是一類(lèi)存在于健康植物體內(nèi)的微生物[1]，一般能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生理活性物質(zhì)，是具有新活性或新結(jié)構(gòu)的天然物質(zhì)的潛在資源庫(kù)[2-4]。國(guó)內(nèi)外一些近年的研究表明，植物內(nèi)生真菌具有抗氧化活性或可產(chǎn)生抗氧化的活性產(chǎn)物[5-7]。槐樹(shù)Sophora japonica L.為豆科槐屬中的木本藥用植物，含有蕓香甙、甾醇、刺槐素、槲皮素等多種抗氧化活性成分[8-9]，我們對(duì)槐樹(shù)的內(nèi)生真菌的抗氧化活性進(jìn)行了研究，分離到12株槐樹(shù)具有不同程度的總抗氧化活性和清除O2-·的能力的內(nèi)生真菌[10]。在此基礎(chǔ)上，本文選擇了其中抗氧化活性和O2-·清除能力均最高的菌株No.7（鐮刀菌Fusarium sp.），研究了其發(fā)酵液提取物對(duì)·OH的清除效果以及在體外對(duì)小鼠肝組織的脂質(zhì)過(guò)氧化及肝線粒體腫脹度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小白鼠 雌雄各半，體重（22±2）g，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)；槐樹(shù)內(nèi)生真菌抗氧化活性菌株No.7（鐮刀菌Fusarium sp.） 本實(shí)驗(yàn)室自行分離和保存；硫代巴比妥酸（TBA）、水楊酸鈉、硫酸亞鐵（FeSO4）、維生素C（VC）、雙氧水（H2O2）、三氯乙酸（TCA）、蔗糖等 均為分析純。

超速離心機(jī) Sigma公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LGJ1.5冷凍干燥器 北京四環(huán)實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV-2802H紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司；組織勻漿器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 槐樹(shù)內(nèi)生真菌培養(yǎng)液提取物的制備 活化保存槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7菌種，然后取少量菌絲接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，250mL三角瓶、100mL裝液量，27±1℃、150r/min培養(yǎng)7d。濾除菌絲，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)濃縮，加入等量95%乙醇振蕩提取，5000r/min離心10min，棄去沉淀，上清液再濃縮至粘稠后真空干燥得粗提物。

1.2.2 小鼠肝線粒體懸浮液制備[11]小鼠禁食14h，斷頸脫臼處死。取小鼠肝組織在冰浴條件下加入0.25mol/L蔗糖溶液，于組織勻漿器內(nèi)研磨制成10%勻漿，3000r/min、4℃離心20min，沉淀用冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗兩次，合并上清液，10000r/min、4℃離心20min，沉淀用冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗兩次，合并沉淀。所得沉淀即為線粒體，將新鮮制備的線粒體用0.02mol/L、pH7.4的Tris-HCl溶液配成吸光度為0.7～0.8的線粒體懸浮液，冰箱冷藏室中存放備用。

1.2.3 槐樹(shù)內(nèi)生真菌活性菌株發(fā)酵液提取物清除·OH效果的測(cè)定 按Smirnoff的方法改進(jìn)[12]。用FeSO4+ H2O2反應(yīng)體系產(chǎn)生·OH，以·OH氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸光值表示·OH的多少，吸光值越大，·OH越多。反應(yīng)總體系為3mL，依次加入0.15mmol/L FeSO4、2mmol/L水楊酸鈉以及不同濃度的樣品即菌株No.7發(fā)酵液提取物，最后加入6mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)1h，測(cè)510nm處的吸光值。每個(gè)處理重復(fù)三次。吸光值越低，表明清除·OH效果越好。

·OH的清除率（%）={[A0-（Ai-Ai0/A0）]}×100%

其中：A0為空白對(duì)照的吸光值；Ai為含某濃度樣品時(shí)的吸光值；Ai0為無(wú)顯色劑時(shí)樣品的本底值。

1.2.4 對(duì)Fe2+－H2O2誘導(dǎo)肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[13]取小鼠的肝組織，用冷的生理鹽水洗凈后冰浴下勻漿，制成1%的懸浮液。取1%肝勻漿1mL，加入不同濃度的菌株No.7發(fā)酵液提取物樣品0.2mL，再加入6mmol/L FeSO40.1mL和60mmol/L H2O20.1mL，以0.2mL的無(wú)水乙醇代替樣品處理作為誘發(fā)·OH導(dǎo)致過(guò)氧化的對(duì)照組，同時(shí)設(shè)空白處理作為自發(fā)過(guò)氧化的對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)三次。37℃溫育1h后，加入25%TCA 1mL，終止反應(yīng)，以3000r/min離心10min，取上清液，加0.67% TBA 1mL后，沸水浴15min，流水冷卻，測(cè)定532nm處的吸光值和丙二醛（MDA）含量。

對(duì)H2O2誘導(dǎo)過(guò)氧化時(shí)產(chǎn)生MDA的抑制率（%）= [（B0-Bi）/B0]×100%，其中，B0為誘發(fā)過(guò)氧化對(duì)照處理的MDA含量，Bi為某濃度樣品處理下的MDA含量。

1.2.5 對(duì)Fe2+－VC系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體腫脹度的影響[14]取線粒體懸液1.2mL，依次加入0.2mL的菌株No.7發(fā)酵液提取物樣品、0.2mL的42.5μmol/L FeSO4和0.1mL的0.85mmol/L VC，在520nm處測(cè)吸光值，每20min測(cè)一次，觀察吸光值下降情況。以不加發(fā)酵液樣品的處理為誘發(fā)·OH導(dǎo)致過(guò)氧化損傷的對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)三次。

1.2.6 對(duì)Fe2+－VC系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[15]線粒體懸液1mL，依次加入0.2mL的菌株No.7發(fā)酵液提取物樣品、0.1mL的0.2mol/L pH7.4 Tris-HCl緩沖溶液、0.05mL的3.5mol/L KCl溶液、0.2mL的5mmol/L FeSO4和0.1mL的10mmol/L VC，37℃溫育1h，測(cè)定532nm處的吸光值和MDA含量，計(jì)算MDA抑制率。每個(gè)處理重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 槐樹(shù)內(nèi)生真菌活性菌株發(fā)酵液提取物清除·OH的效果

表1 槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物清除·OH的效果（n=3，±s）Table 1 The scavenging effect of extracts from the endophytic fungal strain No.7 on·OH（n=3，±s）

表1 槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物清除·OH的效果（n=3，±s）Table 1 The scavenging effect of extracts from the endophytic fungal strain No.7 on·OH（n=3，±s）

注：A為與對(duì)照相比差異極顯著（Plt;0.01）。

·OH清除率（%）空白對(duì)照CK 0 1.596±0.047處理1 50 1.312±0.004A 17.79處理2 100 1.056±0.069A 33.83處理3 200 0.424±0.018A 73.43處理4 500 0.125±0.035A 92.17處理 樣品濃度（μg/mL） A510nm

由表1的結(jié)果可以看出，槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物不同濃度樣品的各處理的A510nm值明顯低于對(duì)照，表明不同濃度的樣品均具有清除·OH的作用，且隨著樣品濃度的增加，其清除·OH的效果亦增加。當(dāng)樣品濃度達(dá)到200μg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率超過(guò)50%，濃度達(dá)500μg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率高達(dá)92.17%。

2.2 對(duì)Fe2+-H2O2誘導(dǎo)肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

表2 槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物抑制Fe2++H2O2誘發(fā)的MDA的效果（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on malondialdehyde induced by Fe2++H2O2（n=3，±s）

表2 槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物抑制Fe2++H2O2誘發(fā)的MDA的效果（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on malondialdehyde induced by Fe2++H2O2（n=3，±s）

注：與Fe2++H2O2處理相比的差異顯著性，A：Plt;0.01；a：Plt;0.05。

（μg/mL） A532nm 丙二醛抑制率（%）空白對(duì)照CK 0 0.176±0.068 Fe2++H2O2 0 0.521±0.088 Fe2++H2O2+樣品 25 0.399±0.077A 23.42 Fe2++H2O2+樣品 50 0.311±0.025A 40.31 Fe2++H2O2+樣品 100 0.285±0.050A 45.30 Fe2++H2O2+樣品 200 0.198±0.045a 62.00處理 樣品濃度

由表2可見(jiàn)，F(xiàn)e2++H2O2處理與對(duì)照相比的A532nm值顯著增加，說(shuō)明Fe2++H2O2反應(yīng)體系產(chǎn)生的·OH可促使小鼠肝組織體外脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。Fe2++H2O2+菌株No.7發(fā)酵液提取物樣品的各處理對(duì)MDA的生成均具有抑制作用，說(shuō)明槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物可抑制誘發(fā)的·OH所致小鼠肝組織體外脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，而且抑制誘發(fā)的小鼠肝組織體外脂質(zhì)過(guò)氧化時(shí)產(chǎn)生MDA的能力隨樣品濃度增加而提高。

2.3 對(duì)Fe2+－VC系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體腫脹度的影響

表3的結(jié)果表明，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，作為對(duì)照的模型處理組的A520nm持續(xù)下降，以處理后20min內(nèi)下降的幅度最大，說(shuō)明·OH誘導(dǎo)加速了小鼠肝線粒體在體外的氧化損傷，導(dǎo)致腫脹迅速加重。菌株No.7發(fā)酵液提取物樣品各處理的A520nm也逐漸下降，表明其中也發(fā)生了線粒體在體外因氧化損傷而發(fā)生腫脹，不過(guò)，含No.7發(fā)酵液提取物樣品的三組處理與Fe2++VC的模型處理相比下降緩慢，而且在相同作用時(shí)間內(nèi)的A520nm值均高于空白對(duì)照，表明No.7發(fā)酵液提取物可在一定程度上抑制·OH所導(dǎo)致的氧化，使小鼠肝線粒體的腫脹減輕，損傷程度降低，且菌株No.7發(fā)酵液提取物濃度與減輕小鼠肝在體外因氧化損傷而導(dǎo)致的線粒體腫脹的效果之間具有量效關(guān)系。

表3 槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物對(duì)Fe2++VC作用小鼠肝線粒體的吸光值（A520，n=3，±s）Table3 Effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on mitochondria swelling induced by Fe2++VC（n=3，±s）

表3 槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物對(duì)Fe2++VC作用小鼠肝線粒體的吸光值（A520，n=3，±s）Table3 Effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on mitochondria swelling induced by Fe2++VC（n=3，±s）

注：A為與損傷對(duì)照相比差異極顯著（Plt;0.01）；a為與空白對(duì)照相比差異顯著（Plt;0.05）。

20 40 60 80 100 120空白對(duì)照CK 0.410±0.014 0.366±0.009 0.351±0.031 0.342±0.015 0.333±0.013 0.328±0.033 0.316±0.013損傷處理對(duì)照 0.403±0.012 0.286±0.007 0.266±0.016 0.262±0.040 0.256±0.026 0.253±0.031 0.245±0.048樣品（50μg/mL） 0.413±0.014 0.387±0.010Aa 0.369±0.020Aa 0.358±0.010Aa 0.350±0.015Aa 0.346±0.029Aa 0.347±0.060Aa樣品（100μg/mL） 0.421±0.021 0.415±0.011Aa 0.410±0.080Aa 0.398±0.033Aa 0.385±0.036Aa 0.376±0.028Aa 0.370±0.023Aa樣品（200μg/mL） 0.430±0.020 0.423±0.024Aa 0.420±0.027Aa 0.418±0.021Aa 0.414±0.031Aa 0.412±0.014Aa 0.409±0.032Aa處理 時(shí)間（min）0

2.4 對(duì)Fe2+－VC系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

表4 槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物抑制Fe2+－VC系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的效果（n=3，±s）Table 4 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on lipid peroxidation in liver mitochondria induced by FeSO4－VC（n=3，±s）

表4 槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物抑制Fe2+－VC系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的效果（n=3，±s）Table 4 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on lipid peroxidation in liver mitochondria induced by FeSO4－VC（n=3，±s）

注：A為與Fe2++VC處理相比差異極顯著（Plt;0.01）。

處理 樣品濃度（μg/mL） A532nm 丙二醛抑制率（%）空白對(duì)照CK 0 0.321±0.002 Fe2++VC 0 0.630±0.028A Fe2++VC+樣品 50 0.440±0.008A 30.16 Fe2++VC+樣品 100 0.409±0.004A 35.08 Fe2++VC+樣品 200 0.376±0.028A 40.32 Fe2++VC+樣品 400 0.339±0.029A 46.19

由表4可見(jiàn)，槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物能夠在體外顯著抑制FeSO4－VC系統(tǒng)誘導(dǎo)小鼠肝線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成，且在體外抑制肝線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化時(shí)產(chǎn)生MDA的能力隨樣品濃度增加而提高，具有較好的量效關(guān)系。提取物濃度為400μg/mL時(shí)，對(duì)Fe2+－VC系統(tǒng)誘導(dǎo)的肝線粒體MDA發(fā)生量的抑制率達(dá)46.19%，高濃度的No.7發(fā)酵液提取物對(duì)線粒體膜有較好的保護(hù)作用。

3 討論

大量的研究表明羥自由基（·OH）是體內(nèi)最活潑的活性氧，可介導(dǎo)許多病理變化，因此對(duì)羥自由基的清除能力是評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物抗氧化活性能力的重要指標(biāo)之一[16-17]。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化生成的過(guò)氧化物的最終分解產(chǎn)物，其含量變化可反映生物膜的受損程度和細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度，也間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。肝臟是反映脂質(zhì)過(guò)氧化較為敏感的器官，所以肝臟中MDA的含量間接反映著細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度[18]。過(guò)氧化損傷會(huì)導(dǎo)致生物膜通透性增加，進(jìn)而引起線粒體膨脹和紅細(xì)胞溶血等。本文在對(duì)槐樹(shù)內(nèi)生真菌抗氧化活性和清除O2-·的能力研究的基礎(chǔ)上[10]，進(jìn)一步研究了槐樹(shù)內(nèi)生真菌抗氧化活性菌株No.7發(fā)酵液提取物在體外對(duì)小鼠肝勻漿和線粒體的脂質(zhì)過(guò)氧化及肝線粒體腫脹度的影響。實(shí)驗(yàn)處理中，不論是Fe2+-H2O2還是Fe2+-VC的·OH發(fā)生系統(tǒng)都能引起小鼠肝組織的體外脂質(zhì)過(guò)氧化，并誘發(fā)MDA的生成。而槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7的發(fā)酵液提取物對(duì)·OH清除效果比較顯著，也能在一定程度上抑制·OH所致的膜脂質(zhì)過(guò)氧化，從而降低或避免了膜系統(tǒng)遭受·OH損傷，保證了膜的流動(dòng)性。表3中，F(xiàn)e2+－VC的·OH發(fā)生系統(tǒng)處理的對(duì)照低于空白處理的正常組，反映出這一·OH發(fā)生系統(tǒng)誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化超過(guò)了自發(fā)過(guò)氧化，而添加槐樹(shù)內(nèi)生真菌菌株No.7發(fā)酵液提取物樣品的處理高于空白處理的正常組，表明其在體外對(duì)誘發(fā)的過(guò)氧化和自發(fā)的過(guò)氧化都具有抑制作用，表現(xiàn)在能夠減輕線粒體因氧化損傷發(fā)生的腫脹，有助于維持正常的生理功能。研究結(jié)果再次證明了植物內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有抗氧化活性作用[5-7]，啟示人們開(kāi)發(fā)和利用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)物生產(chǎn)具有保健價(jià)值或醫(yī)療價(jià)值的產(chǎn)品。

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Effect of fermentation broth extracts of the endophytic fungus isolated from Sophora japonica on lipid peroxidation of mice liver induced by hydroxyl radical in vitro

SHI Jia-qin，CHEN Qiang，WANG Mei-xia，CHEN Shuang-lin*
（College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210046，China）

The antioxidative effect of fermentation broth extracts of the endophytic fungal strain No.7 isolated from Sophora japonica was studied.Hydroxy radical was generated from Fe2+-H2O2and Fe2+-VCsystem；MDA contents in liver homogenate and mitochondria were measured with thiobarbituric acid assay，and the swelling extent of mitochondria was detected by spectrophotometric methods.The results indicated that the fermentation broth extracts of this endophytic fungal strain isolated from Sophora japonica could scavenge·OH，inhibit the generation of MDA and reduce the swelling and oxidative damage of mitochondria.

Sophora japonica；fermented product of endophytic fungi；hydroxyl radical；antioxidation

TS201.4

A

1002-0306（2012）05-0366-04

2011－04－22 *通訊聯(lián)系人

史佳琴（1981-），女，碩士研究生，主要從事微生物發(fā)酵產(chǎn)物的活性研究。