植酸結合膠紅酵母對桃果采后根霉病的控制

楊其亞，張紅印，龐水秀，靳莎莎

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

植酸結合膠紅酵母對桃果采后根霉病的控制

楊其亞，張紅印*，龐水秀，靳莎莎

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

為了尋找一種能夠代替化學殺菌劑控制桃果采后病害的方法，研究了植酸與膠紅酵母結合使用對桃果采后根霉病的控制效果。結果表明，0.15%植酸與膠紅酵母結合使用能顯著降低桃果采后根霉病發病率，防治桃果自然腐爛的發生，并且對果實貯藏品質沒有產生不利影響；能誘導桃果多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性的提高，同時可以抑制丙二醛（MDA）含量的增加。

植酸，膠紅酵母，桃果，根霉病，控制

水果采后病害造成的損失是巨大的[1]，長期以來，世界上對水果病害包括采后病害的控制主要依賴于化學殺菌劑[2]，殺菌劑的長期和大量使用，嚴重污染環境，有損于人體健康。過去十多年，公眾和科學界對于食品和環境中農藥（尤其殺菌劑）殘留問題的關注日益增加。近年來，我國政府對食品的安全性非常重視，各地都在推行放心菜、放心肉、放心水果工程，不使用化肥農藥的綠色水果深受廣大消費者歡迎。另外，我國已加入WTO，國外對水果上的農藥殘留有嚴格的規定，特別是有些國家為了保護本國的經濟利益，實行貿易壁壘，對水果上的農藥和化學殺菌劑殘留實行近乎苛刻的規定。所有這一切都要求我們開發安全、無公害、高效的水果生物保鮮劑。生物保鮮劑既能減輕有害微生物對果蔬侵染，又能保護環境，是生產安全性食品的有效方法。膠紅酵母是被證明的能有效控制水果采后病害的酵母拮抗菌[3]，但其對水果采后病害的防治效力與化學殺菌劑相比仍有較大的差距，因此如何提高拮抗酵母菌的拮抗效力，是提高其對水果采后病害控制水平，并將其應用于水果貯藏保鮮的重要策略之一。植酸作為一種從天然植物中提取的安全、多功能的新型食品添加劑，無致毒性，安全可靠，對果蔬具有良好的保鮮效果。本文研究了植酸結合膠紅酵母對桃果采后根霉病病害的抑制效果，對桃果自然腐爛及貯藏品質的影響以及植酸增強膠紅酵母對桃果采后病害防治效力的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品 正常商業成熟度的桃（Prunus persica Batsch.）果實，品種為大久保，購買于江蘇省句容市，早晨采摘后立即運到實驗室進行實驗，選擇無機械損傷、未感染、大小和成熟度等外觀品質基本一致的果實，分組待用；膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa） 本實驗室保存菌種，在250mL的三角瓶中裝入50mL的NYDB（牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，水1000mL）種子培養基，用接種環接入兩環活化好的R.mucilaginosa，在200r/min，28℃條件下培養20h；將上述培養混合物在7000×g條件下，離心10min，無菌生理鹽水洗滌兩次，去除培養介質，并用無菌生理鹽水重新懸浮酵母細胞，血球記數板調節細胞濃度為5×108cells/mL。在250mL的三角瓶中裝入50mL NYDB培養基，加入上述濃度的酵母細胞培養液1mL（植酸含量分別為0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%），然后在200r/min，28℃條件下培養24h；上述不同處理酵母培養混合物在7000×g條件下，離心10min，并用無菌生理鹽水洗滌2次，去除培養介質，再用無菌生理鹽水稀釋到所需濃度；匍枝根霉（Rhizopus stolonifer） 分離自腐爛的桃果果實，在PDA培養基（200g去皮馬鈴薯加水煮沸20min后過濾，濾液中加入20g葡萄糖，20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000mL）28℃下培養7d后，將其懸浮在無菌水中，用血球計數板在顯微鏡下對病原菌孢子數目進行測定，并根據需要用無菌水調節至所需濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同濃度植酸對桃果根霉病采后病害的抑制效果 果實處理后，用消過毒的打孔器在每個果實表面赤道部位形成5mm（直徑）×3mm（深）的傷口。每個傷口處等量加入30μL不同濃度的植酸溶液（0.05%～0.25%），3h后在每個傷口處加入30μL等量的病原菌孢子（R.stolonifer濃度為1×104spores/mL）。自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫恒濕培養箱中培養（25℃，RH 95%）。每處理重復3次，每次重復12個果實，整個實驗重復2次。經過若干天的培養，計算發病率，以此評價不同濃度植酸的抑菌效果。

1.2.2 植酸結合膠紅酵母對桃果根霉病采后病害的抑制效果 果實處理后，用消過毒的打孔器在每個果實表面赤道部位形成5mm（直徑）×3mm（深）的傷口。每個傷口處等量加入30μL溶液：a.1×108cells/mL的酵母菌（含0.05%～0.25%植酸）；b.1×108cells/mL的酵母菌；c.無菌水（作為對照）。3h后在每個傷口處加入30μL等量的病原菌孢子（R.stolonifer濃度為1×104spores/mL）。自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫恒濕培養箱中培養（25℃，RH 95%）。每處理重復3次，每次重復12個果實，整個實驗重復2次。經過若干天的培養，計算發病率，以此評價膠紅酵母菌種（Rhodotorula mucilaginosa）的抑菌效果。

1.2.3 植酸與膠紅酵母結合對桃果自然腐爛及貯藏品質的影響 實驗水果采摘后直接用以下處理浸泡果實30s：a.1×108cells/mL的酵母菌（含0.15%植酸）；b. 1×108cells/mL的酵母菌；c.0.15%植酸；d.無菌水（作為對照）。然后將果實放在塑料筐內，風干后用保鮮膜密封。貯藏于4℃冰柜，30d后轉入25℃培養箱貯藏，7d后觀察果實腐爛情況，計算腐爛率，并進行貯藏品質分析。每處理重復3次，每次重復10個果實，整個實驗重復2次。

貯藏品質分析方法如下：采用稱重法測定失重；采用TA－XT2i質構分析儀測試硬度；參照Larrigaudière等的方法[4]測定總可溶性固形物；參照郝建軍等的方法[5]測定可滴定酸度；采用紫外快速測定法[6]測定維生素C的含量；采用改進的Lee的方法[7]測定褐變度。1.2.4 植酸與膠紅酵母結合對果實抗性相關酶活性及脂質過氧化作用的影響 果實處理后，用消過毒的打孔器在每個果實表面赤道部位形成5mm（直徑）×3mm（深）的傷口，每個傷口處等量加入30μL以下處理液：a.1×108cells/mL的酵母菌（含0.15%PA）；b.1× 108cells/mL的酵母菌；c.PA（0.15%）；d.無菌水。處理后果實放在塑料筐內，用保鮮膜密封，25℃貯藏，并定期取樣對果實抗性相關酶活性及脂質過氧化作用進行測定。每處理重復3次，整個實驗重復2次。

酶液的提取：取樣時先用無菌刀片刮去傷口表面組織，然后用9mm（直徑）×10mm（深）的打孔器從6個果實傷口處取2g的新鮮果肉組織置于預冷的研缽中。加入10mL 4℃預冷的50mmol/L含1.33mmol/L EDTA和1%PVPP的提取緩沖液。加入少量石英砂在冰浴中充分碾磨，破碎組織，12000×g，4℃條件下離心10min，取上清液作為酶活性等指標樣品。每個處理重復3次，整個實驗重復2次。

PPO活性測定采用鄰苯二酚法[8]，POD活性測定采用愈創木酚法[9]，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定參照Du和Bramlage的方法[10]，略有改動。

1.3 數據處理

實驗結果采用SPSS/PC統計軟件進行鄧肯式多重比較差異分析（取P=0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同濃度植酸對桃果根霉病的抑制效果

如圖1所示，與對照組相比，植酸單獨使用可以降低桃果由匍枝根霉引起的根霉病的發病率，且0.15%植酸對桃果傷口根霉病侵染的抑制效力最為顯著。

圖1 不同濃度植酸對桃根霉病的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of different concentration phytic acid on peaches Rhizopus decay

2.2 植酸與膠紅酵母結合對桃果根霉病的抑制效果

如圖2所示，與對照組相比，膠紅酵母單獨使用可以降低桃果由匍枝根霉引起的根霉病的發病率，且膠紅酵母與0.15%植酸結合使用對桃果傷口根霉病侵染的抑制效力顯著增強。經膠紅酵母與0.15%植酸結合處理的桃果，其根霉病發生率僅為對照組的30.5%，為膠紅酵母單獨處理的57.9%。當植酸濃度為0.05%、0.1%、0.2%、0.25%與膠紅酵母結合使用，與酵母單獨使用并沒有顯著差異。

圖2 不同濃度植酸與膠紅酵母結合對桃根霉病的抑制效果Fig.2 Inhibition effect of different concentration phytic acid combination with Rhodotorula mucilaginosa on peaches Rhizopus decay

2.3 植酸與膠紅酵母結合對桃果自然腐爛及貯藏品質的影響

如圖3所示，0.15%植酸結合膠紅酵母處理對桃果自然腐爛的抑制作用顯著，其處理的桃果自然腐爛率約為膠紅酵母單獨處理的桃果腐爛率的71.4%。同時，如表1所示，與對照組桃果相比，經0.15%植酸與膠紅酵母結合處理的桃果其硬度、可溶性固形物含量無顯著差異，VC含量顯著增加，失重率及褐變度顯著降低，對各項品質指標均不產生有害影響。

圖3 植酸與膠紅酵母結合對桃果自然腐爛的抑制效果Fig.3 Effect of R.mucilaginosa combination with PA treatment on natural rotten percent of peach fruits

2.4 植酸結合膠紅酵母對桃果抗病性酶活及脂質過氧化作用的影響

2.4.1 對桃果POD活性的影響 過氧化物酶（POD）能夠氧化自由基和活性氧，所以常作為植物抗氧化脅迫的重要指標。POD是多功能酶，在果實衰老和抗性生理中都具有重要調節作用，高POD活性被認為是植物果實抗性誘導的一個生理生化標志。從圖4可以看出，膠紅酵母單獨處理和與植酸結合處理的桃果POD活性從開始就快速上升，在第2d達到最高值，結合處理的桃果POD活性除第2d時稍低于膠紅酵母單獨處理，其余都高于其它幾種處理。植酸單獨處理和對照處理的桃果POD活性變化不大。膠紅酵母單獨處理和與植酸結合處理的桃果POD活性與對照相比，顯著提高了傷口組織中POD的活性。

圖4 植酸和膠紅酵母結合對桃果POD活性的影響Fig.4 Effect of R.mucilaginosa and PA on POD activity of peach

圖5 植酸和膠紅酵母結合對桃果PPO活性的影響Fig.5 Effect of R.mucilaginosa and PA on PPO activity of peach

表1 植酸與膠紅酵母結合對桃果儲藏品質的影響Table 1 Effect of R.mucilaginosa and PA treatments on quality parameters of intact peach fruits

2.4.2 對桃果PPO活性的影響 多酚氧化酶（PPO）可催化木質素及其他酚類氧化產物的形成，構成保護性屏蔽而抵抗病菌的入侵，也可以通過形成醌類物質直接發揮抗病作用。酚類物質在植物抗病機理中具有重要作用，多酚氧化酶（PPO）催化酚類物質形成對病原菌更具毒性的醌[11]。增強的PPO活性與植物抗病性相關[12-13]。從圖5可以看出，各個處理的桃果實PPO含量整體呈先上升后下降趨勢。膠紅酵母與植酸結合處理桃果傷口的PPO活性迅速增加，在第2d時達到最大值，是對照處理的1.32倍。膠紅酵母單獨處理在第2d達到最大值后保持穩定狀態。植酸單獨處理在第2d時PPO活性最大且含量接近膠紅酵母單獨處理的。對照處理的PPO活性在第2d達到最大值后迅速下降，在整個實驗階段對照處理的PPO活性都是最低。膠紅酵母與植酸結合處理的PPO含量除第0d與對照處理無顯著差異，其余時間都顯著高于對照。2.4.3 對桃果MDA含量的影響 植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是多不飽和脂肪酸的分解產物，會嚴重損傷生物膜，通常利用它作為脂質過氧化作用的生物標記，MDA含量可以反映細胞脂質過氧化程度和植物衰老指標及對逆境條件的反應的強弱。從圖6可以看出，膠紅酵母單獨處理的、膠紅酵母與植酸結合處理和植酸單獨處理桃果的MDA含量在第1d下降到最低后逐漸上升，而對照處理桃果傷口處MDA含量在第1d先稍微下降，然后上升，在第2d達到最大值。膠紅酵母與植酸結合處理除在第0d外，都處于較低水平，且一直都低于對照，顯著抑制了桃果果實組織中MDA含量的積累。

圖6 植酸和膠紅酵母結合對桃果MDA含量的影響Fig.6 Effect of R.mucilaginosa and PA on MDA concent of peach

3 結論

植酸由于其獨特的結構而具有螯合能力，這種對多價陽離子的強螯合性能，有可能抑制某些酶的活性，從而對病原菌的生長起到抑制作用。本實驗中，不同濃度植酸對實驗菌均有抑制作用，低濃度時抑菌程度不一，0.15%植酸對桃果采后根霉病的抑制效果最佳。植酸作為食品保鮮劑，能有效地提高食品貯存功能和改善食品質量，使其色、香、味保持較長時間而營養不變[12]。本實驗中，膠紅酵母與0.15%植酸結合處理顯著降低桃果貯藏時的褐變度。

本研究表明，0.15%植酸單獨處理對桃果采后根霉病的拮抗效力與對照相比，有顯著提高；且膠紅酵母和0.15%植酸結合處理，對桃果采后根霉病的拮抗效力與單獨使用膠紅酵母相比，有顯著提高。膠紅酵母與0.15%植酸結合處理對桃果自然狀況下病害的發生有顯著的抑制作用，并且對果實貯藏品質沒有產生不利影響。植酸與膠紅酵母結合通過激發果實對病原菌的抗性，誘導果實抗性相關的酶活性，通過誘導了POD、PPO活性的增加，降低了MDA含量來減緩果實貯藏過程中的衰老和病原菌侵入。考慮到植酸是從植物中或植物加工后剩余物中提取的，應用植酸不存在對人體健康和環境的安全性問題，所以植酸作為天然提取物增強酵母拮抗活性的方法是一種有效而且安全的新方法。

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Control of postharvest Rhizopus decay of peaches by phytic acid in combination with Rhodotorula mucilaginosa

YANG Qi-ya，ZHANG Hong-yin*，PANG Shui-xiu，JIN Sha-sha
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

In order to search for an alternative to synthetic fungicides for the control of postharvest decay of peach fruits，the potential of using phytic acid in combination with Rhodotorula mucilaginosa for the control of postharvest Rhizopus decay of peaches was investigated.The results showed that the combined treatment of 0.15%PA with R.mucilaginosa significantly decreased Rhizopus decay incidence of peaches，remarkably controled the natural development of decay of peaches and did not impair postharvest quality parameters of these fruits under normal shelf-life condition.The combined treatment increased the activity of POD，PPO and reduced the content of MDA of peaches.

phytic acid；Rhodotorula mucilaginosa；peaches；Rhizopus decay；control

TS205

A

1002-0306（2012）05-0352-04

2011－05－16 *通訊聯系人

楊其亞（1983-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學。

江蘇省自然科學基金（BK2009214）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目。