呋喃西林代謝物多克隆抗體制備及酶聯免疫吸附分析方法

任海濤，沈玉棟，徐振林，楊金易，雷紅濤，肖治理，王 弘，孫遠明

（廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業大學食品學院，廣東廣州510642）

呋喃西林代謝物多克隆抗體制備及酶聯免疫吸附分析方法

任海濤，沈玉棟，徐振林，楊金易，雷紅濤，肖治理，王 弘，孫遠明*

（廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業大學食品學院，廣東廣州510642）

為了建立檢測呋喃西林代謝物（SEM）的酶聯免疫吸附分析方法（ELISA），將所設計合成的系列半抗原與牛血清白蛋白（BSA）偶聯制備免疫原并免疫新西蘭大白兔，篩選獲得源于新穎半抗原H3的具有高親和力、高特異性抗SEM多克隆抗體。同時，基于設計合成的系列同/異源包被抗原，考察了不同結構包被原對ELISA靈敏度的影響，發現H4-OVA作為異源包被原建立SEM的ELISA檢測方法可獲得最佳的檢測效果，結果顯示：ELISA方法的半抑制濃度（IC50）為12.37ng/mL；定量檢測線性范圍（IC20～IC80）為0.439～110.78ng/mL；檢測限（IC10）達0.07ng/mL，達到了國內外相關檢測限量要求，可應用于實際食品樣品檢測。

硝基西林，半抗原設計，多克隆抗體，異源包被，ELISA（酶聯免疫吸附分析）

呋喃西林是一種硝基呋喃類藥物，代謝快速，代謝物為1-氨基脲（SEM）。近些年來廣泛應用于水產類和禽類養殖[1]。但因其代謝物具有三致作用（致癌、致畸性、致突變），對人體健康與生態平衡造成潛在威脅[2]。歐美和我國先后都明文規定動物源性食品中呋喃西林不得檢出[3]。由于呋喃西林在動物體內分解迅速，其原位穩定性只有數小時，因此檢測呋喃西林母體就顯得沒有意義，然而其代謝物與組織蛋白結合可以形成穩定的化合物，故有必要檢測呋喃西林代謝物[4]。目前國內外報道的對食品中硝基呋喃類藥物檢測主要是通過對SEM進行衍生化處理后（NPSEM），采用液/質聯用分析法（LC-MS）、液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）和免疫學方法等進行檢測[5-7]。但因為儀器法操作復雜、檢測成本高、且難以滿足現場大批量樣品的快速檢測要求。酶聯免疫吸附分析方法（ELISA）因其靈敏、簡便且可以高通量篩選樣品，目前已經發展成一種普遍的快速檢測篩選方法。Cooper等人建立了基于多克隆抗體的酶聯免疫方法檢測呋喃西林殘留，其ELISA最低檢測限為0.25ng/mL[8]。Gao等人制備的單克隆抗體，建立的ELISA方法IC50為1.3ng/mL[9]。但以上報道沒有針對呋喃西林半抗原設計進行深入研究，沒有對同/異源包被進行比較和優化。因此，本工作擬通過設計及合成的系列半抗原，通過半抗原偶聯蛋白制備抗SEM多克隆抗體，同時考察不同結構包被原對ELISA方法靈敏度的影響，旨在建立SEM的靈敏、快速的ELISA檢測方法，為開發相應ELISA試劑盒提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性新西蘭大白兔 廣東省醫學實驗動物中心；呋喃西林衍生物 本實驗室自制；牛血清蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、二環己基碳二亞胺（DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG4000 美國Sigma公司；HRP標記的羊抗兔IgG抗體 武漢博士德生物公司；其它化學試劑 均為國產分析純。

MK3多功能酶標儀 美國Thermo公司；HP1100液質聯用儀 美國Agilent公司；DRX-600核磁共振儀 德國Burker公司；UV-1640A紫外-可見光掃描儀 日本Kyoto公司；6K-15高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 半抗原合成 半抗原H1和H4：1mmol乙醛酸（H1）、醛基苯甲酸（H4）分別與SEM于10mL甲醇中室溫反應2h后，過濾溶液中沉淀。水、甲醇洗滌沉淀，烘干得H1和H4。

H1：MS（ESI negative）m/z：131[M-H]-，1H-NMR（600MHz，d6-DMSO，TMS）：δ5.41（s，1H）；4.66（t，J= 6.8Hz，2H）；2.62（t，J=8.0Hz，2H）。

H4：MS（ESI negative）m/z：206[M-H]-，1H-NMR（600MHz，d6-DMSO，TMS）：δ10.42（s，1H）；7.92（d，J= 8.4Hz，1H）；7.88（s，1H）；7.83（d，J=8.4Hz，1H）。

半抗原H2：氯乙酸鈉1.1mmol、對羥基苯甲醛1mmol于10mL的0.1mol/L NaOH溶液中90～95℃下反應5h。冷卻后用0.5mol/L稀鹽酸調pH。過濾出現的沉淀用乙酸乙酯洗滌并轉至分液漏斗，水洗后分離乙酸乙酯相，乙酸乙酯-石油醚（8∶1）重結晶。水洗、烘干得FPAA[10]。FPAA與SEM合成H2方法同H1。

H2：MS（ESI negative）m/z：236[M-H]-，1H-NMR（600MHz，d6-DMSO，TMS）：δ10.09（s，1H）；7.78（s，1H，）；7.64（d，J=9.0Hz，2H）；6.91（d，J=9.0Hz，2H）；4.71（s，2H）。

半抗原H3：DMF 10mL（除水）、對羥基苯甲醛1mmol于-5℃下加入NaH 2mmol。混勻后滴加溴丁酸乙酯1mL，室溫反應過夜。加0.5g NaOH和20mL甲醇，60℃下反應2h后蒸發甲醇。飽和NaHCO3溶液、乙酸乙酯洗滌后分離水相，0.5mol/L稀鹽酸調pH至析出沉淀并過濾，水洗，烘干得FPBA，FPBA與SEM合成H3方法同H1。

H3：MS（ESI negative）m/z：265[M-H]-，1H-NMR（600MHz，d6-DMSO，TMS）：δ12.16（s，1H）；10.10（s，1H）；7.79（s，1H）；7.64（d，1H，J=8.8Hz）；6.94（d，1H， J=8.8Hz）；6.43（s，1H）；4.02（t，1H，J=6.4Hz）；2.40（t，1H，J=7.3Hz）；1.95（t，1H，J=6.9Hz）。

圖1 半抗原合成圖Fig.1 Hapten synthesis map

1.2.2 抗原制備及鑒定 SEM半抗原均采用活潑脂法制備免疫原H2-BSA、H3-BSA和包被原H1-OVA、H2-OVA、H3-OVA、H4-OVA。同時采用戊二醛法制備包被原H5-OVA。制備及鑒定方法參考文獻[11-12]進行。

1.2.3 免疫程序 采用免疫原H2-BSA、H3-BSA免疫雌性新西蘭大白兔，100μg/只，首次免疫后間隔1個月加強免疫，以后每隔14d加強免疫。每次免疫后第7d取血并采用棋盤滴定法測定抗血清的效價及靈敏度。操作方法參考文獻[13]進行。最后一次免疫后心臟采血獲得抗血清，于4℃下放置過夜并高速離心分離血細胞，將獲得的抗血清分裝，加0.1%的疊氮鈉于-76℃環境下保存。

1.2.4 ELISA方法的建立 篩選出免疫后制備的最優抗血清，依次進行不同包被原-抗血清組合并找出最優的包被原-抗血清組合，基于最優的組合進一步完善ELISA工作各條件，通過比較Abs450nm/IC50的值大小獲得最優條件[14]，進行包被原濃度、抗體反應時間、緩沖溶液體系及濃度、pH等條件的優化。最終采用最佳ELISA工作條件，以SEM衍生物（NPSEM）濃度的對數值為橫坐標，以B/B0（B為添加藥物時的吸光值，B0為不添加藥物時的吸光值）為縱坐標，按照B/B0-logC四參數對數擬合繪制最優包被原條件下的ELISA標準曲線[15]并計算ELISA的半抑制濃度（IC50）、線性檢測范圍（IC20～IC80）、最低檢測限（IC10）。

1.2.5 抗體特異性 以SEM衍生物（NPSEM）及其結構類似物進行間接競爭ELISA，以下式計算交叉反應率：

2 結果與分析

2.1 半抗原/抗原設計、合成及鑒定

設計合成了2個用于免疫的半抗原，5個用于包被的半抗原。設計的免疫原選擇在能充分暴露SEM特征結構的苯環對位分別引入2個、4個碳原子長度手臂，可以最大限度暴露待測母體結構，增強免疫原性。同時苯環的存在使手臂增加了其剛性結構，使得特征結構不至于被蛋白包埋從而起到增強免疫的效果。為了探討抗原抗體識別機制，設計了5個不同結構的包被原用于免疫分析，其中H2-OVA、H3-OVA為其對應免疫原的同源包被，H1-OVA、H4-OVA、H5-OVA為異源包被。異源包被中H1-OVA、H5-OVA因為沒有連接苯環間隔臂而呈現出與免疫半抗原更大的差異。符合異源包被的設計思路[16]。

合成的所有半抗原其質譜、核磁共振波譜數據經分析均能正確歸屬并與目標物結構一致，表明半抗原合成成功。抗原紫外掃描的結果也明顯可以看出，相應半抗原和載體蛋白比較，偶聯后的全抗原的最大紫外吸收峰在210～230nm和270～285nm波長范圍內變化明顯，證明抗原合成成功。

2.2 抗體特性的鑒定

固定包被原濃度為1μg/mL，ELISA測定抗血清效價，結果顯示H3-BSA免疫后產生的抗血清效價高于H2-BSA免疫后產生的抗血清（如圖2，圖3）。制備的4個碳原子手臂長度半抗原H3-BSA免疫應答優于2個碳原子手臂長度的半抗原H2-BSA，說明蛋白與半抗原偶聯間隔臂為4個碳原子的長度適宜，與蛋白偶聯后并沒有被蛋白的三維結構掩蓋，單羧酸手臂與苯環組合形成了剛性的手臂結構，從而可以支撐起半抗原的決定簇[17]。同時設計的手臂位于重要特征官能團的遠端，利于誘導動物產生較強的免疫應答效應。

圖2 H2-BSA血清效價圖Fig.2 Serum titer of H2-BSA

圖3 H3-BSA血清效價圖Fig.3 Serum titer of H3-BSA

確定最優抗血清后，ELISA測定不同包被原對ELISA靈敏度的影響并選用最優的抗體-包被原組合（如表1）。結果顯示異源包被H4-OVA與免疫原H3-OVA的組合測得的Abs450nm/IC50最高，故在進一步的優化當中選用異源包被H4-OVA。

2.3 ELISA方法的建立

對包被原濃度、抗體反應時間、緩沖溶液體系及濃度、pH等工作條件進行優化。通過比較Abs450nm/IC50的大小獲得最優條件（如圖4）。包被濃度和緩沖溶液對ELISA影響明顯，說明高或低的包被原濃度都是不適合的，濃度低時包被原量不足，板孔內可供抗體結合的抗原決定簇少；濃度高時易產生空間位阻導致供抗體結合的有效抗原決定簇少，都會降低靈敏度。再次，PBS緩沖溶液為最優，說明此緩沖溶液的離子強度有利于改善ELISA的工作條件。pH則主要影響抗體和酶的等電點，從而影響抗原抗體的相互作用[18]。最終確立的最佳ELISA工作條件為：包被抗原濃度為50ng/mL、抗體反應時間為40min、酶標抗體反應時間為30min、最優緩沖溶液體系為0.05mol/L pH為7.1的PBS緩沖溶液。

圖4 不同工作條件對ELISA方法靈敏度的影響Fig.4 Effect of different conditions on ELISA sensitivity

2.4 ELISA標準曲線的建立

基于上述最佳ELISA工作條件，以50ng/mL H4-OVA為異源包被原，建立了檢測SEM衍生物的ELISA標準曲線。結果顯示（如圖5）：IC50為12.37ng/mL（SEM相對應量4.46ng/mL），定量檢測線性范圍為（IC20～IC80）0.439～110.78ng/mL（SEM相對應量0.158～39.94ng/mL），檢測限為0.07ng/mL（SEM相對應量0.025ng/mL）。

圖5 ELISA標準曲線Fig.5 ELISA standard curve

2.5 包被原對ELISA靈敏度的影響

基于上述最佳ELISA工作條件，考察了不同包被原包被，ELISA測定了抑制情況（如表2），結果顯示：只含待測物質對象SEM特征結構片段的異源包被H1-OVA和H5-OVA因為剔除了苯環僅保留了SEM特征結構，造成了抗體識別困難。說明雖然合理的異源包被能在不降低特異性的基礎上大幅度提高方法靈敏度，但是在設計異源包被時也要保證與抗體間的親和力，不能過高更不宜過低。同時，結果顯示未剔除苯環的異源包被H4-OVA靈敏度更優，進一步驗證了異源包被與抗體的親和力適中才能提高ELISA檢測的靈敏度。而同源包被H3-OVA上的半抗原結構和抗體識別的主體骨架結構相同，從而造成ELISA檢測的靈敏度不高[19]。因此，最終本文選擇H4-OVA作為最佳ELISA方法的包被原。

表2 不同包被原對ELISA檢測靈敏度的影響（ng/mL）Table 2 Effect of different package antigen on ELISA sensitivity（ng/mL）

2.6 方法特異性

表3 多克隆抗體ELISA方法特異性測定Table 3 ELISA specificity determination on polyclonal antibody

選用最優包被原H4-OVA，最優ELISA工作條件下測定各藥物的IC50并進一步計算交叉反應率（CR）。結果顯示抗體對其它硝基呋喃藥物及結構類似物均無交叉反應，特異性良好（如表3）。唯一出現交叉反應的是呋喃西林原藥，但作為檢測呋喃西林代謝物的方法，檢測其代謝物最終也是為了說明呋喃西林原藥的使用與否，因此與原藥的交叉并不會影響到對監測結果的判定。

3 結論

針對呋喃西林代謝物（SEM），通過設計合成的新穎免疫半抗原H3，成功制備了具有高特異性、高親和力的抗SEM多克隆抗體。其次，通過不同的抗體-包被原組合，從5種包被原中篩選出最優的異源包被原H4-OVA。基于此優化ELISA工作條件并建立了標準工作曲線。同時，討論了包被原對ELISA靈敏度的影響。最終，測定了ELISA方法的特異性并成功建立了靈敏度高的SEM異源ELISA檢測方法，此方法檢測靈敏度和定量線性范圍均達到國內外相關檢測限量要求，為食品中非法添加呋喃西林造成的食品安全問題提供了技術保障，為進一步開發、研制其快速檢測試劑盒提供了理論基礎。

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Production and identification of polyclonal antibody detect nitrofurazone metabolite and development of enzyme-linked immunosorbent assay

REN Hai-tao，SHEN Yu-dong，XU Zhen-lin，YANG Jin-yi，LEI Hong-tao，XIAO Zhi-li，WANG Hong，SUN Yuan-ming*
（Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province，College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

In order that a method of Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method was established to detect nitrofurazone metabolite（SEM），series haptens were synthesized and coupled to bovine serum albumin（BSA）as immunogen which was used to immunize New Zealand white rabbit.An anti-SEM PcAb original from new hapten-H3was obtained and was highly specific to SEM.Effect of ELISA method sensitivity on the different structure coating antigen（homology/heterologous）was inspected.ELISA detection method against SEM could achieve the best result on account of heterologous feature structure H4-OVA.Results showed：half inhibiting concentration（IC50）was 12.37ng/mL，the quantitative detection linear range（IC20～IC80）was 0.439～110.78ng/mL，and the limit of detection limit（IC10）was 0.07ng/mL for ELISA method，which made it met requirement of relevant detection limit at home and abroad and could be applied in the actual demand of food samples detection.

nitrofurazone；Hapten design；polyclonal antibody；heterogenous package；ELISA

TS207.3

A

1002-0306（2012）05-0330-05

2011－05－03 *通訊聯系人

任海濤（1984-），男，碩士，研究方向：食品質量與安全。

國家自然科學基金（30901005）；廣東省科技計劃項目（2009B011300005，2010A090200084，2009B090300409）；華南農業大學校長基金(5100-K08198)。