新疆紅棗多糖酶法提取工藝研究

吳洪斌，王永剛，劉成江，王俊剛，趙志永，金新文，*

（1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆石河子832000；2.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鶴壁458030）

新疆紅棗多糖酶法提取工藝研究

吳洪斌1，王永剛2，劉成江1，王俊剛1，趙志永1，金新文1，*

（1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆石河子832000；2.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鶴壁458030）

以新疆紅棗為原料，利用纖維素酶對紅棗多糖進(jìn)行提取，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳提取工藝，旨在提高紅棗多糖提取含量。實(shí)驗(yàn)證明，酶添加量0.85mg/mL、酶解時(shí)間60min、酶解溫度50.0℃、液料比10∶1為紅棗多糖最佳提取條件，其多糖提取含量達(dá)7.71%。通過對上述各種因素的優(yōu)化，確定了紅棗多糖的最佳提取條件，為相關(guān)生產(chǎn)加工企業(yè)提供一定的參考依據(jù)和理論支持。

紅棗，多糖，纖維素酶，提取工藝

紅棗（Zizyphus Jujube Mill）又名大棗、華棗，是鼠李科棗屬植物棗樹的果實(shí)。紅棗原產(chǎn)于我國，是我國的特產(chǎn)果品，栽培面積及產(chǎn)量均占世界的90%以上[1]。紅棗營養(yǎng)豐富，富含糖類、粗纖維、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有多種營養(yǎng)保健功能[2]。多糖（Polysaccharide）又稱多聚糖，是由單糖聚合而成的高分子化合物，廣泛存在于動植物的組織中。目前有相關(guān)研究表明，紅棗多糖可提高小鼠血液、肝臟及腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化氫酶（CAT）活性[3]；可使運(yùn)動小鼠部分組織的抗氧化酶活性發(fā)生不同程度的良性變化，減少自由基生成，提高機(jī)體免疫力[4]；硫酸化修飾可顯著增強(qiáng)紅棗多糖對超氧化物陰離子、羥自由基、DPPH自由基的清除作用[5]；另外紅棗多糖還具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等作用[6-10]。由上述研究結(jié)果可以看出，紅棗多糖在改善人體生理功能方面起到至關(guān)重要的作用。因此，進(jìn)行提取紅棗多糖工藝研究，確定其最佳工藝參數(shù)，進(jìn)而提高紅棗多糖的含量，具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過研究紅棗多糖的提取工藝，對酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度及液料比等因素進(jìn)行優(yōu)化，確定紅棗多糖最佳提取工藝，為相關(guān)生產(chǎn)加工企業(yè)提供一定的參考依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗 產(chǎn)自新疆阿克蘇農(nóng)一師，紅棗經(jīng)挑選、水洗后，放置在真空干燥箱中60℃干燥12h，去核后粉碎至粒度為80目的粉末，作為原料待用；無水乙醇、丙酮、濃鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；纖維素酶 sigma公司；以上普通試劑 均為分析純；酶 均為生化試劑。

DZF-6050真空干燥箱 上海鴻都電子科技有限公司；SHHW21.600AⅡ三用電熱恒溫箱 天津市泰斯特儀器有限公司；LGJ-18S冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；TGL-10B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；BS223S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)、752N紫外可見分光光度計(jì) 上海精科。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅棗多糖提取工藝 紅棗粉→酶法浸提→滅酶→抽濾殘?jiān)鷾p壓濃縮→乙醇沉淀多糖→冷凍干燥→紅棗粗多糖→復(fù)溶→脫色→脫蛋白→乙醇沉淀多糖→冷凍干燥→精制多糖

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取在105℃烘干至恒重的分析純葡萄糖0.01g，配制成0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1、2、3、4、5、6mL放置于10mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到不同濃度梯度的葡萄糖溶液。分別移取1mL上述溶液置于10mL具塞試管中，依次加入5%苯酚溶液1.0mL及5mL濃硫酸。充分混合后置于100℃水浴中，靜置30min。取出迅速冷卻至室溫，在490nm處進(jìn)行比色。以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0067x+0.0002，R2=0.9988。

1.2.3 紅棗多糖提取工藝單因素實(shí)驗(yàn) 通過參考大量相關(guān)文獻(xiàn)和進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇適宜的因素水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，除待定因素外，其他參數(shù)均為最優(yōu)水平：液料比為10∶1，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為60min，酶添加量為0.9mg/mL，結(jié)果以紅棗多糖提取率為評判標(biāo)準(zhǔn)。其方法如下：酶添加量：液料比10∶1，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間為3h，酶添加量分別為0.6、0.9、1.2、1.5mg/mL，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；酶解時(shí)間：液料比為10∶1，酶解溫度為50℃，酶添加量為0.9mg/mL，酶解時(shí)間分別為20、40、60、80min，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；酶解溫度：液料比為10∶1，酶添加量為0.9mg/mL，酶解時(shí)間為3h，酶解溫度分別為30、40、50、60℃，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；液料比：酶解溫度為50℃，酶添加量為0.9mg/mL，酶解時(shí)間為3h，液料比分別為6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 紅棗多糖提取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Design-Expert 7.0軟件Box-Behnken的組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定響應(yīng)面設(shè)計(jì)每個因子的適宜范圍。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)（酶添加量0.9mg/mL，酶解時(shí)間60min，酶解溫度為50℃，液料比為10∶1）上，選取酶添加量（A，mg/mL）、酶解時(shí)間（B，min）、酶解溫度（C，℃）、液料比（D，mL/g）四因素為自變量，各自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1，0，1編碼，因素及水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)水平及編碼設(shè)計(jì)Table 1 Level and code of variables of response surface method

1.2.5 測定方法 多糖的測定方法：采用苯酚硫酸法[11]進(jìn)行測定（多糖含量以葡萄糖計(jì)）。

多糖提取率（%）=（提取液中多糖的含量/紅棗干物質(zhì)）×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均做平行實(shí)驗(yàn)，采用Design-Expert 7.0數(shù)據(jù)處理軟件，進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗多糖單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過上述實(shí)驗(yàn)操作，得到各因素影響如圖1所示。

圖1 各因素對紅棗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of different factors on extract yield

通過對上述單因素結(jié)果分析可知，隨著酶解溫度的增加，紅棗多糖含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在50℃時(shí)達(dá)到最大。紅棗多糖提取率在50℃后開始下降是由于溫度升高導(dǎo)致酶活性降低，酶促作用受到抑制，從而引起提取率下降，因此，選擇酶解溫度為50℃較為合適；隨著液料比的增加，紅棗多糖提取率呈現(xiàn)上升趨勢，但是在10∶1之后，上升趨勢變緩，從經(jīng)濟(jì)成本角度分析，選擇液料比10∶1較為合適；在酶添加量為0.6～0.9mg/mL時(shí)，隨著酶添加量的增加，多糖提取率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)添加量＞0.9mg/mL時(shí)，提取率增加平緩。可能由于當(dāng)酶添加量為0.9mg/mL時(shí)，底物已與酶結(jié)合完全，酶添加量的增加不會改變底物與酶的結(jié)合狀況。考慮到酶添加量的增加將會增加成本，選擇酶添加量為0.9mg/mL較為合適；隨著酶解時(shí)間的增加，紅棗多糖含量呈現(xiàn)上升趨勢，60min以后上升趨勢不明顯。分析是由于60min以后酶與底物已充分反應(yīng)。為減少因酶解時(shí)間增加而帶來的能源浪費(fèi)，提高效率，綜合提取率及成本考慮，選擇60min較為合適。通過上述分析，單因素篩選出各因素的最佳條件分別為酶添加量0.9mg/mL、酶解時(shí)間60min、酶解溫度為50℃、液料比為10∶1。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

本次共29個實(shí)驗(yàn)，1～24個實(shí)驗(yàn)是析因?qū)嶒?yàn)，25～29是中心實(shí)驗(yàn)。其中析因點(diǎn)為自變量，取值在由四個因素構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；0點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，0點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用來估算實(shí)驗(yàn)誤差。對酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、液料比進(jìn)行編碼，以紅棗多糖提取率為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

2.2.1 效應(yīng)模式的選擇 選擇何種效應(yīng)模式對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，是得到最適當(dāng)?shù)南鄳?yīng)曲面模型的關(guān)鍵步驟，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性（Linear）、兩因子交互作用（2FI）和二階效應(yīng)（Quadratic）三種模式的方差分析，結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The experiment design and results of response surface method

表3 不同效應(yīng)模式方差分析表Table 3 Analysis of variance of different effect model

由表3分析可知，線性（Linear）及兩因子交互作用（2FI）模式下的回歸項(xiàng)，模型p值為0.7081及0.9252，說明70.8%和92.5%的F值變異是由誤差造成的，兩種模式的失擬項(xiàng)均小于0.01（0.0043、0.0028），說明兩種模式下回歸方程在回歸空間內(nèi)擬合度很差。在二階效應(yīng)（Quadratic）的模型下，該模型回歸極顯著（p＜0.01），表明僅有小于0.01%的F值變異是由誤差造成的；失擬性不顯著（P＞0.05），說明回歸方程在回歸空間內(nèi)有較好的擬合度，可用回歸方程進(jìn)行預(yù)測。綜合考慮，應(yīng)選擇二階效應(yīng)模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行模型分析。在選定的二階效應(yīng)模型下，對響應(yīng)面進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface method

由表4分析可知，該模型回歸極顯著（p＜0.01），失擬性不顯著（P＞0.05），說明可用回歸方程進(jìn)行預(yù)測。方程系數(shù)R2=0.9278，不良適配度僅有0.0722，顯示響應(yīng)值與各變量之間的回歸系數(shù)呈現(xiàn)高比例，代表回歸線與回歸數(shù)據(jù)間的相對適配度較好，上述四因素可解釋92.8%的響應(yīng)值的變化建立的模型準(zhǔn)確度高。信噪比（Adeq Precision）=12.04＞4，說明此模型可準(zhǔn)確的反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分析結(jié)果顯示，酶添加量、酶添加量與液料比交互作用、酶解溫度液料比交互作用、加酶量的二次項(xiàng)、酶解時(shí)間二次項(xiàng)、酶解溫度的二次項(xiàng)、液料比的二次項(xiàng)對紅棗多糖紅棗的提取率影響顯著（p值分別為：0.0054，0.0130，0.0391，＜0.0001，＜0.0001，＜0.0001及＜0.0001，均小于0.05）。根據(jù)參數(shù)分析結(jié)果得到紅棗多糖提取率的二階響應(yīng)面回歸模型為：

Y=-36.02+12.07A+0.16B+0.67C+3.50D-0.03AB-0.05AC+0.63AD+3.33×10-4BC-5.00×10-3BD+8.75×10-3CD-8.42A2-8.56×10-4B2-7.45×10-4C2-0.21D2

此回歸模型的R2=0.9278，F(xiàn)=12.85，p＜0.00001，說明模型在概率a=0.01水平上能夠擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。2.2.2 各因素相互作用的影響 上述響應(yīng)面方程中各個因素交互作用影響可通過圖2～圖7所展示的響應(yīng)面三維圖及等高線圖反映出來。等高線的形狀可反映出交互作用的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。通過等高線可以直觀看出AD兩因素、BD兩因素間交互作用顯著，即酶添加量與液料比、酶解時(shí)間與液料比之間交互作用顯著，與方差分析表中結(jié)論相同（表4）。從三維圖可以看出，過高或過低的各因素水平對紅棗多糖提取率均有不利的影響。經(jīng)分析認(rèn)為隨著酶添加量的增加，反應(yīng)速度加快，但是該反應(yīng)為可逆反應(yīng)，正反應(yīng)增加的同時(shí)，逆反應(yīng)也在增加，當(dāng)酶用量大于0.85mg/mL時(shí)，酶添加量過大，反應(yīng)系統(tǒng)中總含水量增加，反應(yīng)向逆方向進(jìn)行，提取率下降；溫度對酶法提取的影響主要有以下兩方面：在溫度較低的情況下，提高溫度可加快酶提速度，一般來說，溫度增加10℃，反應(yīng)速度增加1～2倍；當(dāng)溫度上升到該酶的變性溫度時(shí)，會完成酶的變性過程。隨著酶活力的喪失，酶解能力下降，進(jìn)而引起提取率下降；酶解時(shí)間和液料比兩因素對提取率的影響較小，隨著兩因素用量的增加，提取率呈現(xiàn)前期快速上升后期變化平緩的趨勢，從經(jīng)濟(jì)成本角度考慮，選擇在響應(yīng)面設(shè)計(jì)的0點(diǎn)水平較為合理。響應(yīng)面方差分析及單因素結(jié)果亦可從其他角度得出相同結(jié)論。

圖2 酶添加量和酶解時(shí)間對紅棗多糖提取率的響應(yīng)面Fig.2 Surface response plot of extract time and enzyme concentration on extract yield

圖3 酶添加量和酶解溫度對紅棗多糖提取率的響應(yīng)面Fig.3 Surface response plot of extract temperature and enzyme concentration on extract yield

圖4 酶添加量和液料比對紅棗多糖提取率的響應(yīng)面Fig.4 Surface response plot of liquid to solid ratio and enzyme concentration on extract yield

圖5 酶解時(shí)間和酶解溫度對紅棗多糖提取率的響應(yīng)面Fig.5 Surface response plot of extract temperature and extract time on extract yield

圖6 酶解時(shí)間和液料比對紅棗多糖提取率的響應(yīng)面Fig.6 Surface response plot of liquid to solid rate and extract time on extract yield

圖7 酶解溫度和液料比對紅棗多糖提取率的響應(yīng)面Fig.7 Surface response plot of extract temperature and liquid to solid ratio on extract yield

2.2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化及模型驗(yàn)證 根據(jù)最低成本及最大效益的原則，由回歸模型來預(yù)測最佳反應(yīng)條件。利用Design Expert分析，其最佳條件為：酶添加量為0.85mg/mL，酶解時(shí)間59.03min，酶解溫度為49.18℃，液料比為10.01∶1，其多糖提取率達(dá)7.67%。

為了驗(yàn)證模型方程的適用性，同時(shí)考慮到操作的方便性，將上述條件調(diào)整為酶添加量為0.85mg/mL，酶解時(shí)間60min，酶解溫度為50℃，液料比為10∶1，平行進(jìn)行五組實(shí)驗(yàn)，最后得到多糖提取率平均值為7.71%，接近預(yù)測值。說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型擬合良好，建立的回歸模型能真實(shí)地反映酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度及液料比對紅棗多糖提取率的影響，通過此模型優(yōu)化能夠有效地提高紅棗多糖的提取率。

2.3 所得樣品性質(zhì)測定

所得多糖樣品為淡黃色粉末，無味，易溶于熱水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑；經(jīng)比色反應(yīng)測定，苯酚硫酸、蒽酮反應(yīng)均呈陽性，可證明樣品為糖類化合物。茚三酮反應(yīng)呈微弱陽性，說明樣品中還有少量殘余的蛋白質(zhì)，需對其進(jìn)行進(jìn)一步的純化分離。

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，采用二次多項(xiàng)式逐步回歸方法，確定了紅棗多糖的最佳提取工藝。發(fā)現(xiàn)在酶添加量0.85mg/mL，酶解時(shí)間60min，酶解溫度為50℃，液料比為10∶1條件下，得到的紅棗多糖提取率為7.71%，相比其他相關(guān)報(bào)告均有顯著性提高[12-13]。該工藝參數(shù)可用于實(shí)際生產(chǎn)中，對于相關(guān)生產(chǎn)加工企業(yè)具有一定的參考價(jià)值和理論指導(dǎo)意義。

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Study on the enzyme extraction technology of polysaccharide from Xinjiang Zizyphus Jujube

WU Hong-bin1，WANG Yong-gang2，LIU Cheng-jiang1，WANG Jun-gang1，ZHAO Zhi-yong1，JIN Xin-wen1，*
（1.Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science，Shihezi 832000，China；2.Hebi College of Vocation and Technology，Hebi 458030，China）

Choosing Xinjiang Zizyphus Jujube as raw material and using cellulase to extract polysaccharide from Zizyphus Jujube，the extraction yield of Zizyphus Jujube polysaccharide could be improved with the optimizing extract technology through response surface method（RSM）.The best extraction condition was liquid solid ratio of 10∶1，temperature of 50℃，extraction time of 60min，and enzyme volume of 0.85mg/mL.Under this condition，the Zizyphus Jujube polysaccharide extract yield was up to 7.71%.Reference basis and theory support could be provided to some relative manufactories when the reasonable process was decided through the study of the best extraction condition of Zizyphus Jujube polysaccharide.

Zizyphus Jujube；polysaccharide；cellulase；extraction technology

TS255.1

B

1002-0306（2012）05-0292-05

2011－04－28 *通訊聯(lián)系人

吳洪斌（1980-），男，助理研究員，碩士，研究方向：食品營養(yǎng)與農(nóng)產(chǎn)品加工。

兵團(tuán)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2010GG61）。