超聲輔助酶法提取廢次煙葉中綠原酸、煙堿工藝研究

朱 松，婁在祥，陳尚衛，戴 軍，王洪新，*

（1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

超聲輔助酶法提取廢次煙葉中綠原酸、煙堿工藝研究

朱 松1，婁在祥2，陳尚衛1，戴 軍1，王洪新2，*

（1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

將超聲波技術與酶法相結合提取煙葉中的綠原酸和煙堿。通過實驗得出最適宜的酶為纖維素酶；在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗優化超聲波輔助酶法同時提取綠原酸和煙堿的最佳條件為：酶用量1%（以煙葉質量計）、酶解時間1.5h，酶解溫度50℃。在最佳條件下，綠原酸的提取率為91.5%，煙堿的提取率為92.2%，與其他提取方法比較，超聲波輔助酶法對煙葉中綠原酸、煙堿的提取具有明顯的促進作用。

煙葉，綠原酸，煙堿，超聲波，酶，提取

我國是煙草種植大國，每年都有大量的低次煙葉亟待處理與利用，否則將造成環境污染和資源浪費[1]。綠原酸是煙草中含量最多、最重要的多酚類化合物之一，它是植物體在有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的一種苯丙素類化合物[1-3]，具有抗菌、抗病毒、利膽、增高白血球等多種藥理作用[4-6]，是保健品、食品、藥品、化妝品等工業的重要原料。煙堿是天然煙草中最主要的生物堿，是重要的化工和醫藥原料；高純度的煙堿可用作戒煙膏、治療關節痛類藥物的原料，煙堿在生態農業發展中也應用廣泛[7-10]。隨著近年來醫藥、農業、化工等諸多領域的迅速發展，市場上對天然煙堿、綠原酸的需要量與日俱增，因此從廢棄煙草中提取煙堿、綠原酸具有很高的經濟價值，不僅可以變廢為寶，而且可以提高煙草的附加值，實現煙草的綜合利用。超聲波輔助提取可以顯著加速傳質過程，提高提取效率，并且容易實現工業化應用[11]。與傳統的提取方式比較，具有明顯優勢[12]；同時，酶法提取可以迅速破壞細胞壁結構，顯著改善提取效果[13-14]。然而，采用超聲波輔助酶法提取煙葉中活性成分的研究未見報道。本文以煙葉為原料，利用超聲波輔助酶法提取綠原酸與煙堿，并對其提取條件進行了優化。為煙葉有效成分的提取探索一種新的途徑，為廢次煙葉的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烤煙C1F 2009年安徽蚌埠產；綠原酸、煙堿標準品（純度≥98%） 美國Sigma公司；甲醇（色譜純） 美國天地公司；中性蛋白酶（酶活22000U/mL），纖維素酶（酶活20000U/mL），果膠酶（酶活30000U/mL），淀粉酶（酶活30000U/mL） 均為諾維信公司。

BC-R202B型旋轉蒸發儀 上海貝凱生物化工設備有限公司；HH-4S數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；EL204-I電子天平、FE20K酸度計 梅特勒-托利多儀器公司；GZX-GF101-2BS電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械廠；Agilent1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 廢次煙葉中綠原酸、煙堿酶法提取的單因素實驗 以粉碎后的干燥廢次煙葉為原料，加入1∶10（料液比，w/w）的水，再加入酶，恒溫酶解。酶處理后的煙葉在超聲波作用下提取30min。分別考察酶種類、酶用量、酶解時間、提取溫度等對煙草中綠原酸、煙堿提取率的影響。

1.2.2 超聲輔助酶法提取的顯著性作用實驗 在相同條件下，比較酶法處理提取和超聲輔助酶法提取對煙草中綠原酸、煙堿提取率的影響。

1.2.3 超聲輔助酶法提取廢次煙葉中綠原酸、煙堿條件的優化 在單因素實驗結果的基礎上，通過選取酶用量、酶解時間、溫度為考察因素指標，按L9（34）正交表對酶解法提取工藝進行研究，確定廢次煙葉中綠原酸、煙堿酶法提取的最佳工藝參數。

1.2.4 分析方法 綠原酸采用高效液相色譜法定量分析[15]：色譜條件為：色譜柱HypersilBD-C18（250mm× 4.6mm i.d）；流動相25%乙腈＋0.5%乙酸；流速1mL/min；進樣溫度30℃；進樣量10μL；檢測波長280nm。煙堿測定：色譜條件為：Alitima-C18（150mm×4.6mm i.d）；甲醇-磷酸鹽緩沖液（8∶2）；檢測波長262nm；流速1mL/min；柱溫25℃。

2 結果與分析

2.1 酶種類對提取效果的影響

取60目的煙葉粉末5.00g，按1∶10的料水比加50mL水，添加1%的中性蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶，在酶解溫度為50℃下酶解60min，升溫至85℃滅酶，冷卻，HPLC法測定綠原酸和煙堿含量，計算提取率。結果見圖1，經纖維素酶處理后得到的綠原酸、煙堿的提取率為最大，故選擇纖維素酶作為提取煙葉有效成分的最適酶制劑。

圖1 酶種類對煙葉中綠原酸、煙堿提取的影響Fig.1 The effect of various enzymes on the extraction of chlorogenic acid and nicotin from tobacco leaves

2.2 酶用量對提取效果的影響

從圖2可以看出，綠原酸的提取率隨酶用量的增加不斷升高，當酶用量到1.25%時，酶量再增加，綠原酸的提取率沒有明顯變化。這可能是由于當酶用量低于最佳值時，酶解進行得不完全，綠原酸釋放出的量較少，提取率低，當達到最佳值時，酶解反應則較徹底，此時如再繼續增加酶用量，酶解反應進行的程度不會有太大的變化，反而會增加酶的浪費。對煙堿來說，與綠原酸提取率呈相同趨勢，酶用量的增加，煙堿提取率有升高趨勢，當酶用量達到1%時，隨著酶量的增加，煙堿提取率沒有明顯增加。

圖2 酶用量對提取物的影響Fig.2 The effect of amount of enzyme on the extraction of chlorogenic acid and nicotin

2.3 酶解時間對提取效果的影響

圖3 酶解時間對提取物的影響Fig.3 The effect of extraction time on the yields of chlorogenic acid and nicotin

從圖3可以看出，綠原酸的提取率隨酶解時間的增加不斷升高。酶解時間為1h時，綠原酸提取率達到最大值，接著隨著酶解時間的延長而趨于平緩，綠原酸提取率沒有明顯變化。這可能是由于隨著時間的延長，酶活力可以得到充分發揮，酶解反應進行得較完全，提取液中綠原酸含量便不再明顯增加。對煙堿來說，與綠原酸提取率呈相同趨勢，但是當酶解時間為1.5h時，提取率隨溫度的增加增勢變緩。故酶解時間選擇在1h。

2.4 酶解溫度對提取效果的影響

圖4 酶解溫度對提取物的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on the yields of chlorogenic acid and nicotin

從圖4可以看出，綠原酸的提取率隨酶解溫度升高而增加，當溫度為55℃時，到達峰值，酶解溫度繼續升高，綠原酸的提取率開始減少。原因一：由于酶解溫度的增加，綠原酸的鄰苯二酚結構不穩定，高溫加熱易氧化分解；原因二：隨著溫度的升高，底物分子的熱能增加，酶解反應的速率增加，綠原酸提取率增大，但當溫度繼續升高，導致酶活性降低，酶解反應受抑制，因此溫度過高提取液中綠原酸含量便不再明顯增加，甚至有降低的趨勢。對煙堿來說，隨溫度的升高，提取率呈增加趨勢，但是當溫度達到55℃后，提取率隨溫度的增加增勢趨緩。因此，酶解溫度選擇在55℃。

2.5 超聲作用對酶法提取率的顯著性影響

超聲波對煙葉中有效成分提取的影響見表1。由結果可以看出，超聲波作用對煙草中有效成分的提取率有顯著影響，經過超聲波輔助作用后，綠原酸的平均提取率從87.2%提高到91.5%，煙堿的平均提取率的增長更為明顯，從86.7%提高到92.2%。這主要是由于經過超聲波作用后，煙葉的細胞結構被進一步破壞，從而有效改善了綠原酸和煙堿的提取效果。

表1 超聲波處理對綠原酸、煙堿提取的影響Table 1 The effect of ultrasonic treatment on the yields of chlorogenic acid and nicotin

2.6 正交實驗優化提取工藝

在單因素實驗的基礎上，采用L9（34）正交實驗（見表2），考察酶用量（%）、酶解時間（h）與酶解溫度（℃）對綠原酸和煙堿提取率的交叉影響。因素水平表和正交實驗結果見表2和表3。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels

表3 正交實驗方案及結果Table 3 The results of orthogonal test

表4 正交實驗極差分析Table 4 Analysis of the results of orthogonal test

由表4可知，各因素對綠原酸的影響主次順序為A＞B＞C，最優提取方案為A3B3C2，即酶解法提取綠原酸的最佳工藝條件是：酶液量1%，在55℃水浴中處理1.5h；而對于煙堿，各因素主次順序為A＞B＞C，最優提取方案為A3B3C1，即酶解法提取煙堿的最佳工藝條件是：酶液量1%，在45℃水浴中處理1.5h。綜合考慮，同時提取綠原酸、煙堿工藝為酶用量1%（以煙葉質量計）、酶解時間1.5h，酶解溫度50℃。

3 結論

超聲波輔助提取作為一種有效提取方法，因其簡單、方便、快速等優點，在植物的有效成分提取中得到廣泛的應用；纖維素酶可在溫和的條件下將植物組織分解，加速有效成分的釋放，且不破壞其生物活性。將超聲波和纖維素酶結合起來應用于植物活性成分的提取，能強化對植物細胞壁的破壞而更好地促進胞內成分的釋放、擴散和被提取。

本實驗通過正交實驗優化了超聲輔助酶法提取廢次煙葉中綠原酸、煙堿的工藝，得出了煙葉中綠原酸、煙堿同時提取的最佳工藝條件為：酶用量1%（以煙葉質量計）、酶解時間1.5h、酶解溫度50℃。在最佳條件下，綠原酸的提取率為91.5%，煙堿的提取率為92.2%，與其他提取方法比較，超聲波輔助酶法對煙葉中綠原酸、煙堿的提取具有明顯的促進作用。

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Study on ultrasound-assisted enzyme extraction of chlorogenic acid and nicotin from tobacco leaves

ZHU Song1，LOU Zai-xiang2，CHEN Shang-wei1，DAI Jun1，WANG Hong-xin2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science＆Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Ultrasonic technique and enzyme were employed to extract chlorogenic acid and nicotin from tobacco leaves.The results indicated that ultrasonic technique and enzyme treatment significantly promoted the extraction of chlorogenic acid and nicotin.The optimum condition of extraction was obtained through orthogonal test.Experiment results showed that the optimum extraction parameters were：1.0%dry weight of amylase，extraction time of 1.5h，temperature of 50℃.Under this condition the extraction rate of chlorogenic acid was up to 91.5%，and nicotin was 92.2%.

tobacco leaves；chlorogenic acid；nicotin；ultrasonic technique；enzyme；extraction

TS49

B

1002-0306（2012）05-0181-04

2011－05－25 *通訊聯系人

朱松（1979-），男，工程師，研究方向：天然資源開發利用。