一株高效降膽固醇嗜酸乳桿菌在發酵乳中的應用

田建軍，張開屏，張保軍，靳 燁，*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018；2.內蒙古商貿職業學院工程系，內蒙古呼和浩特010018）

一株高效降膽固醇嗜酸乳桿菌在發酵乳中的應用

田建軍1，張開屏2，張保軍1，靳 燁1，*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018；2.內蒙古商貿職業學院工程系，內蒙古呼和浩特010018）

采用高效降膽固醇嗜酸乳桿菌菌株2-2和嗜熱鏈球菌調制發酵劑B，研究了發酵劑B在發酵乳中的應用。通過與傳統保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌調制的發酵劑A的對比，結果表明，發酵劑B有較強的膽固醇去除效力和弱的后酸化能力。4℃條件下存放15d后發酵乳的酸度為103.6°T，發酵乳中乳酸菌活菌數為2.6×107cfu/mL，高于標準的最低限制（≥106cfu/mL）。研究表明，在降膽固醇和抑制后酸化意義上，發酵劑B能夠取代發酵劑A。

嗜酸乳桿菌，降膽固醇，發酵乳，應用

眾所周知，血清中膽固醇的含量被認為是誘發心腦血管疾病的主要因素，統計表明，心腦血管疾病是目前引起人們死亡的主要殺手，而且逐年呈上升趨勢[1-2]。同時，人體總膽固醇濃度與膳食脂質攝入之間有著密切的關系，因此降低食品中膽固醇水平關系到人類的健康。國外大量研究發現，乳酸菌具有降低發酵食品和人體血清膽固醇的作用[3-5]。我國傳統食品資源豐富，尤其在內蒙古少數民族地區，以酸奶為代表的發酵乳制品含有豐富的乳酸菌群，長期的飲食習慣證實了這些菌群的安全性和可靠性。在歐洲和日本市場上已經有了類似的具有輔助降低血清膽固醇的乳酸菌制品以及低膽固醇含量的食品，但是國內在這方面的研究相對較少。因此，目前研究高效降膽固醇的乳酸菌菌種用于食品加工具有重要的意義。本實驗研究了一株高效降膽固醇嗜酸乳桿菌的發酵特性及其對發酵乳中膽固醇的脫出量、發酵乳制品的后酸化和4℃冷藏期間菌株的存活能力，為開發低膽固醇乳制品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高效降膽固醇嗜酸乳桿菌1株 內蒙古農業大學乳品生物技術教育部重點實驗室篩選獲得；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌 內蒙古農業大學益得乳制品實驗廠提供；培養基 MRS培養基[6]；膽固醇、鄰苯二甲醛 Sigma公司，均為分析純；巰基乙酸鈉、正己烷、冰醋酸 均為分析純。

MC-30L型高壓蒸汽滅菌鍋 日本ALP；SPX-150培養箱 中儀國科（北京）科技有限公司；U-8500分光光度計 上海天美公司；PB-20型pH計 北京多斯利儀器系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膽固醇測定方法的建立 采用OPA法[7]（鄰苯二甲醛法）。鄰苯二甲醛溶液現用現配，避光保存。

1.2.1.1 膽固醇標準液的配制 參照文獻[8]配制。

1.2.1.2 膽固醇標準曲線的繪制 參照文獻[8]，以OD550值為橫坐標，膽固醇濃度為縱坐標，繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 膽固醇濃度與OD值的關系Fig.1 The standard curve of cholesterol concentration

1.2.1.3 樣品處理及測定[7，9]待測樣品0.5g→加無水乙醇3.0mL和50%KOH 2.0mL振蕩器混合均勻，60℃水浴保溫10min→冷卻后加入正己烷5.0mL，混合均勻→加雙蒸水3.0mL后再充分混合，室溫下靜置15min使溶液分層→取正己烷層溶液2.0mL抽干→加入鄰苯二甲醛溶液2.0mL，室溫保持10min→加入1.0mL濃硫酸，混合均勻，放置10min后→測定OD550值→根據標準曲線回歸方程計算出樣品中膽固醇的含量。以發酵0h的樣品為對照樣計算其降解率。

膽固醇降解率（%）=膽固醇降解量/最初膽固醇含量×100%

1.2.2 菌株的活化 使用前將菌株在脫脂乳培養基中活化3代，使菌種活力達到最強。

1.2.3 最適生長溫度的測定[10-11，13]菌株于MRS液體培養液中，在不同的溫度下培養10h，測定菌液在620nm的濁度。

1.2.4 生長曲線的測定 滴定酸度（°T）采用吉爾涅爾度表示，pH采用pH計直接測量，生長速度采用濁度法表示，菌落計數采用稀釋平板計數法。

1.2.5 發酵劑的制備 發酵劑A所用菌種：嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌（1∶1）。發酵劑A制備方法：活化好的發酵劑A所用菌株分別按1%的添加量添加到滅菌（121℃、7min）后急冷的脫脂乳培養基中，37℃恒溫培養，培養時間以凝乳后繼續培養2h為準，然后在4℃條件下保存備用。

發酵劑B所用菌種：嗜熱鏈球菌與嗜酸乳桿菌菌株2-2（1∶1）。發酵劑B制備方法：與發酵劑A制備方法相同。

1.2.6 發酵奶的制備

1.2.6.1 發酵奶的基本配方 發酵奶1的基本配方：牛奶92%、白砂糖6%、發酵劑2%。發酵奶2的基本配方：牛奶87%、白砂糖6%、發酵劑2%、奶油5%。

1.2.6.2 發酵奶制備工藝流程 牛奶檢驗→離心凈乳→配料→預熱均質（65℃，20MPa）→殺菌（95℃，10min）→快速冷卻到42℃→添加發酵劑→發酵（42℃）→冷卻→成品

1.2.6.3 發酵奶制備操作要點 按1.2.6.1中發酵奶的基本配方分別配制發酵奶1和2各1000mL，分別預熱后（65℃）在20MPa的條件下均質，分裝、殺菌（95℃，10min）、迅速冷卻降溫至42℃，按2%的添加量添加發酵劑，并在42℃條件下恒溫發酵，發酵到滴定酸度（吉爾涅爾度）65°T時降溫冷卻，由于發酵奶的基本配方和所加發酵劑不同，因此分別記為1-A、1-B、2-A、2-B。其中1和2代表發酵奶的基本配方，A和B代表所加的發酵劑，即A為添加發酵劑A，B為添加發酵劑B。

2 結果與分析

2.1 菌株2-2最適生長溫度

1%（V/V）接種菌株2-2的MRS培養液在不同的溫度下（20、30、35、40、45℃）培養10h后，于波長620nm下測定培養液的濁度，結果如圖2所示。

圖2 菌株2-2在不同溫度下的生長曲線Fig.2 Growth curve of strain 2-2 in different temperature

從圖2可以看出，菌株2-2在不同溫度下（20、30、35、40、45℃）生長時，35℃條件下生長最為旺盛，同時在40℃生長10h的OD值大于30℃條件下生長10h的OD值，說明菌株2-2的最適生長點在35℃和40℃之間，這與乳酸菌通常的培養溫度37℃相符。

2.2 菌株2-2生長曲線

圖3 菌株2-2在MRS中的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain 2-2 in medium of MRS

按1%（v/v）接種量接種菌株2-2于MRS培養基中，37℃恒溫培養24h，每隔2h測定MRS培養液的pH、波長620nm的吸光值和滴定酸度，用測量的數值和對應的時間作圖，就得到菌株2-2在MRS培養液中的生長曲線，如圖3所示。

從圖3可以看出，在MRS液體培養基中，吸光值的變化范圍是0.08～2.22，pH的變化范圍是6.5～3.7，滴定酸度的變化范圍是18～131°T。菌株2-2在2h后進入對數生長期，10h左右進入穩定期。進入穩定期前，隨著時間的增加，pH不斷降低。進入穩定期后，pH基本保持不變，滴定酸度繼續升高，說明菌株2-2進入穩定期以后仍在生長，只是生長和死亡構成動態平衡。

2.3 菌株2-2對發酵乳中膽固醇脫除量的研究

分別采用發酵劑A和發酵劑B制作酸奶，發酵到達終點酸度時，菌株對發酵奶中膽固醇的降解量以及脫除率如表1所示。

由表1可以看出，對于酸奶1和2來說，發酵劑在發酵過程中對基質中膽固醇都有脫除作用，在發酵奶1中發酵劑A的降解量為10.0μg/mL，降解率為5.39%，發酵劑B的降解量為26.55μg/mL，降解率為14.30%；在發酵奶2中發酵劑A的降解量為33.0μg/mL，降解率為7.83%，發酵劑B的降解量為64.7μg/mL，降解率為15.36%。由此可見，在發酵奶1和2中發酵劑B對基質中膽固醇的脫除率大于發酵劑A對基質中膽固醇的脫除率，其差異顯著（P＜0.05）。由此可見，開發新的菌種發酵劑對降低發酵奶自身膽固醇含量具有很大潛力。同時在高脂酸奶中，發酵劑對膽固醇的脫除率均高于普通酸奶，但均小于菌株在培養基MRS-CHOL中培養時對膽固醇的脫除率[8]，可能是由于以下原因造成：其一，在酸奶制作過程中發酵劑的發酵時間較短（一般為4～6h）；其二，酸奶中的膽固醇來源于牛奶或牛奶和奶油，牛奶和奶油中膽固醇的存在形式與MRS-CHOL培養基中添加的膽固醇的存在形式不同，所以菌株對膽固醇的脫除存在差別。

2.4 發酵劑在發酵乳中不同時期的產酸量

采用不同發酵劑發酵的牛乳，在42℃培養過程中定時監測其pH及滴定酸度（吉爾涅爾度°T）的變化。在發酵過程中，在乳酸菌的作用下，分解乳糖產生乳酸，使牛乳的pH下降，滴定酸度上升。測定結果如表2所示，變化趨勢如圖4所示。

圖4表明，發酵劑在乳中的產酸量穩定上升。在發酵初期各供試菌株由于生長緩慢，故產酸能力較弱，宏觀表現為pH的降低和滴定酸度的升高較慢。在培養2h后酸度和pH開始發生明顯變化，到發酵3h后，相互之間的酸度有了明顯差異，1-A發酵乳酸度為57.3而1-B發酵乳的酸度為42.7。1-A發酵到3h后出現凝乳現象，1-B發酵4.5h后出現凝乳現象，1-A發酵4h達到終點酸度，1-B發酵5.5h達到終點酸度。可見在整個發酵過程中，發酵劑A的生長產酸能力強于發酵劑B，發酵劑B要使酸奶達到同樣的終點酸度較發酵劑A延遲1.5h。酸奶通常的發酵時間為4～6h，如果從發酵時間上來判斷，發酵劑B可以作為酸奶的生產用發酵劑。

圖4 42℃發酵乳吉爾涅爾度和pH的變化曲線Fig.4 Changes in titration acidity and pH in milk fermented at 42℃

2.5 在4℃冷藏發酵乳中菌株的存活能力

發酵乳在42℃發酵結束后，轉至4℃條件下冷藏保存，在0d和15d分別取乳樣。以稀釋平板計數法（MRS）測定在15d貯藏過程中供試菌株在冷藏發酵乳中的存活情況，如表3所示。

存活率（%）=[logN/logN0]×100%，其中：N―15d后的活菌數；N0―初始時的活菌數。

由表3中可以看出，在保存初期，發酵奶中活菌數均大于108cfu/mL，在存放兩周后活菌數仍然可以達到107cfu/mL以上，存活率分別為80.63%和83.55%。

在發酵劑B中用嗜酸乳桿菌2-2代替了傳統酸奶發酵劑A中的保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌不變，而嗜酸乳桿菌是微生態制劑中常用的菌種之一，為了確保它們能夠充分發揮其健康促進作用，保證制品中嗜酸乳桿菌較高的活菌數是非常關鍵的。有研究者指出，益生菌制品一個重要的技術特征是“該制品達到消費者的胃腸系統時至少能維持106cfu/mL以上的活菌數，才能發揮潛在的益生效果。”因此，研究嗜酸乳桿菌的存活能力對于開發其相關制品具有重要的實踐意義。該實驗結果表明，4℃條件下，發酵劑所用菌株在乳中保存15d后，發酵奶能維持107cfu/mL的活菌數，它與常用酸奶發酵劑一樣表現出良好的存活能力。這意味著15d的貨架期內，嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵乳仍能滿足其發揮益生作用的條件。

表1 膽固醇降解實驗Table 1 Cholesterol removal rate of starter culture from yoghourt

表2 42℃發酵時的產酸量（n=2）Table 2 Changes in acid production of starter culture in milk feremented at 42℃（n=2）

表3 菌株在4℃冷藏發酵乳中的存活能力（n=2）Table 3 Viability of strains grown in fermented milk and stored at 4℃（n=2）

2.6 在4℃冷藏發酵乳中菌株的產酸能力

除了維持較高的活菌數，評價冷藏期間酸奶的另一指標是看其是否擁有一定的細胞活力以及酸奶的后酸化程度。因此，本研究定期監測了發酵乳在冷藏期間的產酸活力，來反映它們的細胞活力。結果如表4和圖5所示。

表4 發酵乳在4℃冷藏期間酸度變化（n＝3）Table 4 Changes in acid production of in fermented milk and stored at 4℃（n＝3）

圖5給出了發酵乳在冷藏期間pH和酸度變化的情況。隨著保存時間的延長，發酵乳的滴定酸度緩慢上升，1-A的滴定酸度從起始時的66.5°T上升到15d時的136.5°T，pH穩定下降，pH從起始時的4.21下降到15d時的3.72。1-B的滴定酸度從68°T上升到103.6°T，pH從4.23下降到4.05。實驗結果表明，發酵劑中的活體細胞仍然維持一定的酸化活力，其中1-B的后酸化現象明顯低于1-A，說明如果采用發酵劑B來制作酸奶，其產品在冷藏過程中后酸化可以得到一定的改善。

圖5 發酵乳在4℃冷藏期間滴定酸度和pH的變化Fig.5 Changes in titration acidity and pH in fermented milk and stored at 4℃

3 結論

發酵劑B對基質中膽固醇的脫除率大于發酵劑A對基質中膽固醇的脫除率，其差異顯著（P＜0.05）。與發酵劑A相比，發酵劑B后酸化程度低。由發酵劑B調制的發酵乳在4℃條件下存放15d后酸度為103.6°T，乳酸菌活菌數為2.6×107cfu/mL，高于標準的最低限制（≥106cfu/mL）。在降膽固醇和抑制后酸化意義上，發酵劑B能夠取代發酵劑A用于低膽固醇發酵奶的生產加工中。

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Application of a high cholesterol-reducing Lactobacillus acidophilus strain in fermented milk

TIAN Jian-jun1，ZHANG Kai-ping2，ZHANG Bao-jun1，JIN-Ye1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Engineering Department，Inner Mongolia Business Vocational College，Hohhot 010018，China）

The starter culture B was formulated with strain 2-2 of high cholesterol-reducing Lactobacillus acidophilus and Streptococcus thermophilus.Then the application of starter culture B in fermented milk production was studied.By comparison of starter culture B with A that formulaed traditionally with Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus，the results indicated that the starter culture B had abilities of strong cholesterol-reducing and weak post-acidification.After 15d storage at 4℃，the acidity of the fermented milk was 103.6°T and the number of living bacteria was 2.6×107cfu/mL，it was much larger than the minimum standard（≥106cfu/mL）.The study indicated that the starter culture A could be replaced by B in a sense of reducing cholesterol and inhibiting the extent of post-acidification.

Lactobacillus acidophilus；cholesterol-reducing；fermented milk；application

TS252.1

A

1002-0306（2012）05-0163-04

2011－05－18 *通訊聯系人

田建軍（1975-），男，碩士，講師，主要從事乳制品開發研究。

國家“十一五”科技支撐項目（2006BAD04A06）；2012內蒙古自治區高等學校科學研究項目。