顯微鏡自動調光算法研究

黃金寶 宋寶泉 周東翔 蔡宣平

國防科學技術大學電子科學與工程學院信息工程系，長沙 410073

顯微鏡自動調光算法研究

黃金寶 宋寶泉 周東翔 蔡宣平

國防科學技術大學電子科學與工程學院信息工程系，長沙 410073

自動調光是全自動顯微成像中的一項關鍵技術。為了解決已有調光算法空白視野失效、不能實時處理圖像和調光精度低等問題，本文從分析清晰度評價函數隨光源亮度變化曲線入手，驗證了這類函數的調光性能。根據光學顯微鏡的成像原理和觀測目標的特點，考慮與圖像清晰度無關、僅與圖像亮度信息有關的變量，提出了利用空白區域的灰度均值尋找最優光亮度的算法。通過人工訓練樣本方式獲取最優灰度均值，最后通過單變量尋優法得到最優光源亮度。基于自行研發的全自動顯微鏡系統對本文算法進行了驗證，實驗結果證明了算法的有效性。

顯微；自動調光；人工訓練樣本；清晰度評價；灰度均值

microscopy; dimmer automation; artificial training samples; definition evaluation; average gray

引言

隨著光學顯微鏡和計算機技術的結合，顯微鏡系統正在向自動化和智能化方向發展，這種發展趨勢不僅為各種觀察應用提供更直觀、質量更高的圖像，而且為各種檢驗提供更準確的判斷依據，提高了生產效率。因此，國內外的許多公司、科研院所都致力于光學顯微鏡的自動化與智能化研究。尤其是德國和日本的智能光學顯微鏡起步較早，從2004年開始就已經提出了一些有代表性的方法和設備。近年來，國內的智能光學顯微鏡也急起直追，針對不同的應用領域也有不少產品和設備問世。

光學顯微鏡圖像質量的兩個關鍵決定因素是聚焦精度和調光精度，本文主要研究如何在全自動顯微鏡系統中實現精確自動調光。目前對于顯微圖像調光自動化的研究，國外主要有M.Zeder等[1]提出利用人工神經網絡評價細菌顯微圖像質量的方法，將少量圖像處理后得到的空間不變因子作為神經網絡的初值，該方法適用于海量圖像的評估，不適于實時圖像質量評價；德國Leica生產的DM系列顯微鏡自動調光功能是對不同放大倍數的物鏡設定一個經驗亮度值，更換物鏡時設置對應值，不適用于不同玻片不同視野的精確調光；在國內主要有南京航空航天大學的陳葉明[2]提出了以灰度方差為調光目標函數的顯微鏡自動調光算法，利用反射光紅光和透射光綠光雙變量尋找最優光強區間，該算法的缺點是對空白視野失效，評價函數在光源亮度變化過程中有局部極值，需要消除假峰。

本文基于自行研發的全自動顯微鏡系統，首先對常用清晰度評價函數的調光性能進行了分析驗證，然后提出了基于空白區域亮度評價的顯微鏡自動調光算法，通過實驗證明了算法的有效性。

1 調光系統組成及原理

調光系統結構如圖1所示，系統主要由PC機、單片機、數字變阻器、顯微鏡電源電路和鹵素燈等組成。

圖1 自動調光系統結構框圖

調光的基本過程為：PC機通過RS-232通信接口向單片機(MCU)發送光源亮度命令，MCU接收命令后將其轉換成相應的電阻值，然后通過I2C總線設置為數字變阻器的阻值，數字變阻器通過自身電阻調節顯微鏡電源輸出電流的大小，從而調節鹵素燈(Halogen Lamp)的亮度。CCD采集顯微鏡的圖像傳送到PC機，由調光算法或人工觀察判斷圖像亮度是否合適。如果亮度不合適，則調整光源亮度值，PC機重新向MCU發送光源亮度命令，調節鹵素燈亮度，直至圖像亮度合適為止。

本系統中數字變阻器的電阻值可以量化為0～255個等級，隨著數字變阻器阻值增大，光源亮度增強，從而可將顯微鏡的光源亮度由小到大劃分為256份，我們將數字變阻器阻值的等級作為光源亮度值(I)。注意，光源亮度與數字變阻器阻值只是單調遞增關系，不是線性關系，即隨著數字變阻器阻值均勻增大，光源亮度不是均勻增強的。

2 清晰度評價函數調光策略

2.1 清晰度評價函數

清晰度評價函數一般用于聚焦算法的研究。目前提出的評價函數非常多，通常可分為：灰度函數、頻域函數、信息學函數、統計學函數四大類。比較典型的有：圖像灰度方差（Var）、Vollaths函數、圖像的拉普拉斯能量（EOL）[3]、圖像的灰度差分絕對值之和（SMD）[4]、SML函數[5]、Tenengrad函數[6]、Brenner函數[7]等。

2.2 評價函數性能驗證

實驗樣本為肺結核病人的痰涂片。整個實驗的過程是：

第一步，人工將顯微鏡光源調到適當亮度，做白平衡，選定某一有結核桿菌的視野完成自動聚焦，得到清晰圖像。

第二步，設置光源亮度值由小到大逐級變化，采集不同亮度對應的圖像。在實驗中發現，當I<150時整個視野太暗無法觀察，所以只采集150

第三步，將采集到的樣本圖像用清晰度評價函數進行處理，得到評價函數曲線形態。由于不同評價函數的值相差幾個數量級，為了方便在同一坐標系下進行比較，對每個函數進行了歸一化處理。

實驗結果如圖2所示。其中，（a）為3幅采集到的不同亮度的結核桿菌圖像；（b）為評價函數隨光源亮度變化曲線，橫坐標為光源亮度值(I)，縱坐標為歸一化的評價函數值，無色虛線代表最優亮度值的位置。

圖2

根據評價函數曲線和實驗驗證過程，可以得到如下結論：

1）清晰度評價函數在最大峰值附近具有很高的靈敏度，曲線整體平滑，抗噪性能比較好，但是在整個光源亮度變化過程中存在局部極值，而且每個函數都或多或少與最優亮度存在著一定偏差，不滿足單峰性和無偏性的要求。

2）不同的清晰度評價函數隨著光強的變化曲線基本一致，說明它們之間具有很強的相關性。在全自動顯微鏡系統中，自動聚焦算法是基于清晰度評價函數實現的，如果自動調光采用這種策略，將會與自動聚焦算法產生耦合，相互影響，變成二維尋優問題，解決起來比較復雜、且耗時較長。

3）在玻片的掃描過程中，必然存在空白視野。清晰度評價函數曲線在這種情況下會變得非常平滑，此時靈敏度、信噪比等特性消失，不能用于圖像質量評價。

3 空白區域亮度評價調光策略

3.1 基本思路

由于清晰度評價函數調光策略，不能準確反映最優亮度，與聚焦算法耦合，對空白視野失效，有一定的局限性，我們考慮與圖像清晰度無關，只與光亮度有關的變量作為目標函數實現自動調光。

圖3簡要表示了物鏡和玻片的關系。假定此時為正確對焦位置，視野內圖像清晰，物鏡和玻片的距離用d表示。當玻片如圖中實線箭頭所示方向向上移動一段距離，即d減小時，圖像將漸漸模糊，當d足夠小，視野內會變成一片空白，此時圖像上沒有任何細節，只有光亮度信息。

算法基本思路是：選取某個足夠小的d，使得視野內一片空白，只有光亮度信息，不同光源亮度下空白視野的圖像具有不同的灰度信息。我們知道，光源亮度增強，圖像中各個像素灰度值會相應的增大，灰度均值也隨之增大。如果灰度均值與光源亮度之間存在一一對應的關系，那么就可以用灰度均值來代表光源亮度值。在不同玻片、不同視野下，先正確對焦，調節光源亮度，人工選取最好的圖像，采集所對應的空白圖像，采集空白圖像時物鏡和玻片的距離固定為某一個特定值。計算每張空白圖像灰度均值，對得到的所有灰度均值再作一次平均，最終值就是最優灰度均值，將這個值所代表的光源亮度作為最優亮度。

3.2 調光策略流程

依我看翠姨還沒有她從前漂亮呢，不過她們說翠姨漂亮得像棵新開的臘梅。翠姨從來不擦胭脂的，而那天又穿了一件為著將來作新娘子而準備的藍色緞子滿是金花的夾袍。

調光策略主要分為兩個部分。

第一部分，通過人工訓練樣本方式獲取最優灰度均值。

為了實現精確自動調光，調光算法的目標灰度均值要適用于不同玻片的不同視野，我們稱之為最優灰度均值。最優灰度均值的獲取采用人工訓練樣本的方法。實驗中，光源亮度值范圍為200

第一步，大量采集樣本圖像。圖像采集流程如圖4所示。實驗中選取了4張典型肺結核病人的痰涂片，每個玻片隨機選取5個視野，每個視野采集55幅結核桿菌圖像和55幅空白圖像，共計采集2200幅圖像。

圖4 圖像采集流程圖

第二步，分析處理樣本，計算最優灰度均值。通過人工觀察選出每個視野中成像質量最好的結核桿菌圖像，找到與之對應的空白圖像，統計灰度均值，用G表示；對20個視野成像質量最好的圖像灰度均值再做一次平均，作為最優灰度均值，用G0表示。統計結果如表1所示。

表1 圖像灰度均值統計結果

第二部分，通過單變量尋優法得到最優光源亮度。

系統初始化完成后，玻片調至z軸起始位置下方40μm處，此時視野中沒有任何內容信息，只有亮度信息，然后開始調光。算法流程如圖10所示。灰度均值隨著光源亮度增強是單調遞增且一一對應的，最接近G0的灰度均值所對應的圖像的亮度就是最優光源亮度。

4 實驗驗證

我們用原始系統和自動調光系統作了對比試驗。將G0=181.65作為目標灰度均值應用于調光算法中。兩個系統分別在不同初始光源亮度下采集了圖像，I0為初始光源亮度。實驗結果如圖5和圖6所示。

圖5 原始系統采集的結核桿菌圖像

圖6 自動調光系統采集的結核桿菌圖像

由實驗結果可以看出，原始系統采集的圖像質量非常依賴初始光源亮度，當光源亮度過大或過小時，被動采集圖像，得到的圖像質量很差；自動調光系統能夠自適應的改變光源亮度，不同初始光源亮度下都能采集到質量很高的圖像。結果表明空白區域亮度評價調光算法亮度調節準確，適用于不同的初始條件，實現了全自動顯微鏡系統自動調光的功能。

5 結語

本文針對全自動顯微鏡系統中光源亮度對圖像質量產生嚴重影響的問題，分析驗證了常用清晰度評價函數的調光性能，總結了這種方法的可行性和局限性。提出了空白區域亮度評價調光策略，首先通過人工訓練樣本的方式，得到最優灰度均值，然后將該最優值應用于調光算法中，編程實現調光功能，通過對比實驗證明了算法的有效性。

[1]M. Zeder, E. Kohler, J. Pernthaler. Automated quality assessment of autonomously acquired microscopic images of fluorescently stained bacteria. Original Article, Cytometry Part A : 76-85,2010.

[2]陳葉明.顯微目標信息融合與調光自動化技術研究[碩士學位論文].南京航空航天大學，10-17，2003.

[3]翟永平,周東翔,劉云輝.聚焦函數性能評價指標設計及最優函數選取.光學學報，31(4):0418002,2011.

[4]R.A.Jarvis. Focus optimization criteria for computer image processing [J]. Microscope, 24(2):163～180,1976.

[5]J.M.Tenenbaum. Accommodation in computer vision [Ph.D thesis]: Stanford University, 1970.

[6]S.K.Nayar, Y.Nakagawa. Shape from focus [J]. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, 16(8):824～831, 1994.

[7]J.F.Brenner,B.S.Dew, J.B.Horton,et al. An automated microscope for cytological research: A preliminary evaluation [J]. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry,24(1):100～11, 1976.

[8]李艷軍，左洪福，吳振鋒.顯微觀測技術的新進展及其應用[J].光學儀器，2002(2):1～6

Dimmer Automation Algorithm for Microscopy

Huang Jinbao，Song Baoquan，Zhou Dongxiang，Cai Xuanping
Department of Information Engineering, College of Electronics Science and Engineering, National University of Defense Technology, 410073,Changsha, P.R.China

Dimmer automation is one of the key issues in automatic microscopy. The traditional methods suffer from blank vision failure, not real-time image processing and low dimmer accuracy. This paper validates dimmer performance of the definition evaluation function through the change curve. Considering the optical microscope imaging principle and characteristics of the observed object, this paper proposes an algorithm searching best light intensity based on average gray of blank areas. Then acquire the best average gray through artificial training samples and best light intensity through single variable optimization method. Experimental investigation has been conducted to demonstrate the validity of the proposed method.

10.3969/j.issn.1001-8972.2012.21.010

國家自然科學基金, 項目批準號:No.60975023