100例江西地區健康漢族人群ABO血型基因分型的研究

毛征宇，萬本愿，王文丁，陳 會，徐紅萍

(1、江西省人民醫院輸血科，江西 南昌 330006；2、江西省臨床檢驗中心，江西 南昌 330006；3、江西省人民醫院檢驗科，江西 南昌 330006)

準確鑒定血型是保證臨床輸血安全、防止重大醫療事故發生的重要保證。常規應用的ABO血型血清學正反定型技術，具有簡單實用的特點，但亦存在一定的局限性，而基因分型的方法在某種程度上克服了血清學實驗的弱點，可以作為血清學方法的有益補充。本研究采用血清學和PCRSSP法兩種方法對比鑒定ABO血型，旨在江西地區臨床輸血工作中，建立起穩定的PCR-SSP基因分型方法。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2006年10月至2011年10月，隨機選取江西地區健康漢族無關個體100例，年齡18～55歲。抽取靜脈血3ml并EDTA抗凝。

1.2 試劑抗A、抗B血型定型試劑(北京金豪制藥股份有限公司)，AC、BC、OC及正反定型微柱凝膠卡(長春博訊生物技術有限責任公司)，ABO基因分型試劑盒(美國G&T公司)，基因組DNA提取試劑盒、Taq酶和 Marker(TaKaRa公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 DNA提取嚴格按TaKaRa公司試劑盒說明書的要求進行操作。抽提完成后，取10μl DNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下觀察結果，并使用紫外分光光度計測定其OD值然后計算濃度(UV752N型紫外分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司)，DNA終濃度調節至40～70ng/μl。

1.3.2 PCR擴增 PCR反應體系的總體積為9μl，包含1μl DNA樣品，1μl Taq酶 (預先經 15倍稀釋，0.33-0.5U)，基本引物 Mix-A、Mix-A201、Mix-B和Mix-O的混合液7μl。PCR擴增條件(1000-Series Thermal Cyclers型PCR儀，美國Bio-rad公司)：預變性 95℃ 5min→變性 95℃ 30s→退火 60℃30s→延伸72℃ 90s(30個循環)→終末延伸72℃5min→保溫4℃。

1.3.3 PCR產物的電泳分析 PCR產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，以100V電壓電泳25min后紫外燈下觀察條帶，擴增條帶與內對照207bp(人生長激素基因，hGH)及DL 500 DNA Marker相比較并讀取結果，凝膠成像系統中拍照記錄(Uvipro型凝膠成像分析系統，美國Bio-Rad公司)。

1.3.4 結果判斷 根據是否產生特異性目的片段以及片段的長度大小來確定基因分型，判讀標準和基因分型格局如表1、表2所示。

1.3.5 血清學分型方法 正反定型凝膠微柱法和鹽水凝集試管法，操作過程和判讀標準參照文獻[1]。

2 結果

2.1 血清學分型結果 采用ABO血型凝膠微柱卡和鹽水凝集試管法對100例江西地區健康漢族無關個體進行血清學分型，檢測出A型32例(32.0%)，B 型 24 例(24.0%)，AB 型 8 例(8.0%)，O 型36例 (36.0%)。計算其基因頻率可知：A基因為0.2253，B 基因為 0.1753，O 基因為 0.5998。

表1 ABO基因分型的判讀參數

表2 基因分型的電泳格局

2.2 PCR-SSP法基因分型結果 采用PCR-SSP法進行基因分型，共檢出4種等位基因(即A、B、O和A201)9種基因型：A/O 型14例(14.0%)，A/A201型11例 (10.0%)，A201/O 型 6例 (6.0%)，A/A 型 1 例(1.0%)，B/O 型 17 例(17.0%)，B/B 型 7 例(7.0%)，A/B 型 5例(5.0%)，A201/B 型 3例(3.0%)，O/O 型 36例(36.0%)。基因分型結果與血清學分型結果一致。

3 討論

ABO血型基因分型技術在國內外進展迅速，甚至有國外學者撰文探討對于具有百年歷史的凝集試驗是否該說“再見”[2]。我們采用血清學和基因分型兩種方法對100名江西健康漢族個體進行血型鑒定，結果顯示：血清學分型與基因分型結果一致，江西地區人群以O型為多，基因頻率的分布：A基因為0.2253，B基因為0.1753，O基因為0.5998，這與我國漢族人群的分布情況基本吻合，同時也符合ABO血型在中國分布特點的推斷[3]：從北向南方向，B基因頻率逐漸下降，而O基因頻率升高，云、貴、川和長江中下游地區A基因頻率升高。

隨著輸血學和組織、器官移植技術的研究發展，傳統血清學方法的若干不足也逐漸暴露出來[4]。對于亞型和變異型、特殊疾病導致的抗原表達異常(白血病、腫瘤等)[5]、細菌污染或血漿蛋白紊亂導致的弱凝集或假凝集、不規則抗體和自身抗體等情況的分辨率不高，往往需要進行抗人球蛋白試驗、吸收放散實驗、唾液物質鑒定等額外的驗證性實驗；結果判讀的主觀性較大，不同實驗室甚至不同實驗人員之間的結果可比性不強；試劑的質量對于鑒定結果有決定性影響等[6，7]。然而運用基因分型技術進行ABO血型鑒定，克服了血清學方法易受抗原活性竟爭、抗體的特異性及微生物污染等因素的影響的缺點，不需要做繁雜的一系列血清學實驗，并且，正反定型、吸收放散實驗、鹽水凝集試管法、抗人球蛋白實驗等血清學方法只能鑒定表型，而基因分型技術則可以直接確定ABO血型基因型，有效的解決了疑難血型鑒定難的問題，所以說，基因分型技術不但可以補充血清學方法的不足，對于疑難血型的正確診斷也有重要作用，對臨床輸血醫學水平的提高有很大的意義[8]。

[1]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[M].第3版.南京:東南大學出版社,2006,246-256.

[2]趙桐茂,人類血型分型的新紀元[J].中國輸血雜志,2007,20(1):1-2.

[3]陳稚勇,趙桐茂,張工梁.中國人ABO血型分布[J].遺傳,1982,4(2):4-7.

[4]周炳能.29例ABO血型正反定型不一致原因探討[J].實驗與檢驗醫學,2010,28(2):189-190.

[5]吳敏華,陳活強,蔡葵.惡性血液病引起ABO血型鑒定困難的探討[J].實驗與檢驗醫學,2008,26(6):690-692.

[6]嚴建新,陳敏霞.浙江沿海地區漢族人A型及AB型血型的基因亞型研究[J].中國衛生檢驗雜志,2010,20(2):341-344.

[7]雷國華,鐘清蘭,熊永萍,等.微柱凝膠免疫檢測法在配血及血型鑒定中的應用[J].實驗與檢驗醫學,2010,28(2):202-204.

[8]黃新寶,鞠海英.基因分型在正反定型不符病例中的診斷意義[J].中國實驗診斷學,2011,15(7):1211-1212.