慢性粒細胞白血病患者骨髓間充質干細胞的分離培養及成脂分化

馮丹琴，黃 波，劉 靜，李 靜，章海斌，肖 蕓，熊火梅，陳希敏，王小中

(1、南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西 南昌 330006；2、南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌 330006)

ABL酪氨酸激酶抑制劑如伊馬替尼、達沙替尼、尼羅替尼是BCR-ABL1激酶誘導的慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)慢性期的一線治療藥物。酪氨酸激酶抑制劑可以大量減少白血病細胞，但卻無法清除白血病干細胞。所以，一些患者用酪氨酸激酶抑制劑治療后產生耐藥性[1]。對于酪氨酸激酶抑制劑耐藥的CML患者來說，異體基因造血干細胞移植是首選的治療方法。在造血干細胞移植之前用酪氨酸酶抑制劑對病人進行治療，能為移植創造良好狀態[2-3]。然而，造血干細胞移植誘發移植物抗宿主病已見報道[4-5]，為了減少移植排斥反應，可以用患者自身的BMSCs支持造血干細胞的造血作用。本實驗進行了CML患者BMSCs的分離培養及成脂分化，為后續研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 肝素化骨髓來源于南昌大學第二附屬醫院和第一附屬醫院血液科CML患者，Ficoll分離液(1.077g/ml)(Solarbio)，低糖 DMEM(L-DMEM)培養基(Hyclone)，胎牛血清 FBS(Hyclone)，青鏈霉素混合液(Solarbio)，胰蛋白酶-EDTA消化液0.25%(Solarbio)，地塞米松(Sigma)，1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤 IBMX(Sigma)，吲哚美辛(Sigma)，牛胰島素(上海第一生化藥業)，油紅O染料(Sigma)，4%多聚甲醛(碧云天生物公司)，分析純異丙醇都是商品化試劑。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養 在10ml玻璃離心管中加入2ml Ficoll分離液，再將2ml肝素化骨髓緩慢加至Ficoll分離液表面。2000r/min離心20min，用微量移液器小心吸出分界面的白膜層，PBS清洗1遍，用L-DMEM培養基(含有10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)重懸，以 1×106密度接種于塑料培養瓶中，放入37℃ 、5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養箱培養。3d后全量換液，以后每隔2d全量換液。待貼壁細胞密度達到60%后用胰酶消化傳代。

1.2.2 BMSCs的成脂分化 第二代BMSCs密度達到60%～70%后，用胰酶消化，以密度1×105個細胞接種到35mm培養皿中。培養6d后，待細胞密度達到50%～60%，加入誘導液 (L-DMEM培養基含有10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、地塞米松1μmol/L、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤0.5mmol/L、吲哚美辛 50μmol/L、牛胰島素 5mg/L)。每隔2d用誘導液全量換液。

1.2.3 油紅O染色 油紅O染料工作液的配制：油紅O染料粉用異丙醇完全溶解，成為油紅O染料的儲存液。將儲存液和三蒸水按3:2比例稀釋后過濾，配制成油紅O染料的工作液(要求工作液配制完成后，20min內用完)。成脂誘導培養3周后，去掉培養皿中的細胞培養基，加入4%多聚甲醛2ml進行預固定，5min后去除，再加等量的新鮮4%多聚甲醛，固定60min，去除多聚甲醛。用PBS清洗1遍，待細胞培養皿完全干后再加油紅O染料工作液2ml染35min，去除油紅O染料工作液，用三蒸水洗2遍，在倒置顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 BMCSs的分離、培養 Ficoll分離液(1.077g/ml)分離得到的單個核細胞3 d后貼壁，倒置顯微鏡下觀察到，細胞呈細而長的梭形或多角形，12d后細胞密度達到60%。細胞傳代后，3d可貼壁，10d后細胞密度達到60%～70%，見圖1。

圖1 分離培養第二代BMCSs的形態(第10d，×400)

2.2 BMSCs的成脂分化 加入誘導液48h就有少量的細胞出現折光性強、少而小的脂肪滴，到第8d細胞內脂肪滴明顯增多、脂肪滴體積也逐漸增大，見圖2。第21d有80%的細胞都分化為脂肪細胞，細胞外形變為圓形或橢圓形，脂肪滴大而多、折光性強，見圖3。

圖2 第三代BMCSs成脂誘導后形態(第8d，×400)

圖3 第三代BMCSs成脂誘導后形態(第21d，×400)

2.3 油紅O染料 油紅O染色后，細胞內的脂肪滴染成紅色，見圖4。

圖4 第三代BMCSs成脂誘導后油紅染色形態(第21d，×400)

3 討論

BMSCs具有自我更新及多向分化的潛能，在一定條件下能誘導分化成骨、軟骨、骨骼肌、肌腱、韌帶、真皮和脂肪[6]。本實驗用地塞米松、牛胰島素、吲哚美辛、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤成功誘導了慢性粒細胞白血病患者的BMSCs向脂肪細胞分化。表明，本實驗分離的慢性粒細胞白血病患者的BMSCs具有較強的分化能力，狀態良好。Ito等[7]證明人BMSCs只有在地塞米松、牛胰島素、吲哚美辛、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤同時存在的情況下才能分化為脂肪細胞，其中任何一種藥物單獨作用都無法成功誘導成脂分化。這其中的藥理作用機制至今仍未完全闡明。

CML是多能造血干細胞惡性增生性疾病，其特征是具有費城染色體和融合的BCR-ABL基因。對于ABL酪氨酸激酶抑制劑耐藥CML患者，同種異體基因骨髓移植是首選的治療方法[2]。然而骨髓移植存在移植物抗宿主反應，容易導致移植失敗。Lazarus[8-9]和 Jootar[10]研究表明，BMSCs 能強烈而直接地抑制T淋巴細胞的增生。因BMSCs具有抑制免疫反應的特性，能有效減少移植物抗宿主的反應疾病，所以，在骨髓移植中起到重要的作用。Lazarus[8-9]研究結果顯示，惡性疾病患者的BMSCs在體外擴增后，能通過靜脈安全有效地輸入患者自身體內，并且顯著減少了急性和慢性的移植物抗宿主反應。BMSCs不僅具有抑制免疫反應的特性，而且是骨髓微環境的重要組成部分，能夠支持造血干細胞的造血作用。Koc[11]和Noort[12]研究表明BMSCs能分泌大量的細胞因子 (包括IL-6、IL-7、IL-8、IL-11，Flt-3 ligand,和 SCF 等)支持骨髓造血干細胞的造血作用，促進造血干細胞的移植。另外，Zhao等[13]研究顯示CML患者的BMSCs并不存在費城染色體，也不表達BCR-ABL融合基因，它們能通過分泌造血干細胞的細胞因子，支持造血細胞的生長。和同種異體的BMSCs相比，病人自身的BMSCs是理想的干細胞資源。CML患者自身的BMSCs的移植不僅能減少移植物抗宿主的反應疾病，而且能促進造血功能的恢復，所以BMSCs運用于CML的治療具有廣泛前景。CML患者急變時骨髓標本比較難抽取，考慮到標本的寶貴，本次實驗采用2ml的骨髓標本。CML患者骨髓中的白細胞數比較高，但實際分離培養BMSCs時，BMSCs不容易貼壁生長。細胞首先在培養瓶中散在聚集貼壁生長，呈細長梭形或多角形。在等待散在聚集的BMSCs融合時，發現它們很難完全融合，時間長了容易老化或成骨分化。Zhang等[14]研究發現BMSCs和CML細胞共培養時，BMSCs能通過分泌大量的α-干擾素抑制CML細胞的生長。由此我們推測，當CML細胞瘋狂生長的同時，是否反向抑制著BMSCs的生長？這還有待于進一步的驗證。本實驗室建立的慢性粒細胞白血病患者骨髓間充質干細胞的培養方法為我們后續的實驗研究打下了良好基礎。

[1]Skorski T.Chronic myeloid leukemia cells refractory/resistant to tyrosine kinase inhibitors are genetically unstable and may cause relapse and malignant progression to the terminal disease state[J].Leuk Lymphoma,2011,52(1):23-29.

[2]Suttorp M,Millot F.Treatment of pediatric chronic myeloid leukemia in the year 2010:use of tyrosine kinase inhibitors and stem-cell transplantation[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2010,2010:368-376.

[3]Oyekunle A,Klyuchnikov E,Ocheni S,et al.Challenges for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in chronic myeloid leukemia in the era of tyrosine kinase inhibitors[J].Acta Haematol,2011,126(1):30-39.

[4]劉 川,鄒葉青,李 劍.人類白細胞抗原(HLA)基因分型在造血干細胞移植中的應用[J].實驗與檢驗醫學,2008,26(6):587-588.

[5]鄧雪蓉,任漢云,岑溪南,等.100例異基因造血干細胞移植后移植物抗宿主病的發生及其對患者復發和生存的影響[J].中國實驗血液學雜志,2009,17(4):5.

[6]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.

[7]Ito T,Tsuruta S,Tomita K,et al.Genes that integrate multiple adipogenic signaling pathways in human mesenchymal stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,409(4):786-791.

[8]Lazarus H,Curtin P,Devine S,et al.Role of mesenchymal stem cells(MSC)in allogeneic transplantation:Early phase I clinical results[J].Blood,2000,96(11):392A-392A.

[9]Lazarus HM,Haynesworth SE,Gerson SL,et al.Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells):implications for therapeutic use[J].Bone Marrow Transplant,1995,16(4):557-564.

[10]Jootar S,Pornprasertsud N,Petvises S,et al.Bone marrow derived mesenchymal stem cells from chronic myeloid leukemia t(9;22)patients are devoid of Philadelphia chromosome and support cord blood stem cell expansion[J].Leuk Res,2006,30(12):1493-1498.

[11]Koc ON,Gerson SL,Cooper BW,et al.Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy[J].Journal of Clinical Oncology,2000,18(2):307-316.

[12]Noort WA,Kruisselbrink AB,in't Anker PS,et al.Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord bloodderived CD34(+)cells in NOD/SCID mice[J].Experimental Hematology,2002,30(8):870-878.

[13]Zhao Z,Tang X,You Y,et al.Assessment of bone marrow mesenchymal stem cell biological characteristics and support hemotopoiesis function in patients with chronic myeloid leukemia[J].Leuk Res,2006,30(8):993-1003.

[14]張海梅,張連生.人骨髓間充質干細胞對慢性粒細胞白血病細胞增殖的影響及其機制探討[J].癌癥,2009,28(1):29-32.