微波法提取灰樹花多糖的工藝研究*

袁筱琦 李行諾 陳佳麗 顏繼忠

(浙江工業(yè)大學藥學院,浙江 杭州 310014)

灰樹花多糖是藥食兩用菌灰樹花 (Grifola frondosa)的主要有效成分,具有明顯的抗腫瘤、抗HIV病毒、抗輻射,調(diào)節(jié)免疫功能,治療肝炎等藥理作用[1]。試驗表明,灰樹花多糖的抑腫瘤率可達86.3%,優(yōu)于香菇多糖[2]。

微波 (Microwave)可穿透溶劑,到達物料內(nèi)部維管束和細胞內(nèi),由于吸收微波能,細胞內(nèi)部迅速升溫,使細胞內(nèi)部壓力超過細胞壁所能承受的能力,導致細胞破裂,使細胞內(nèi)物質流出,而有利于藥材有效成分的提取[3]。微波提取技術具有選擇性高,對有效成分破壞小,提取效率高,溶劑少,能耗低,無污染,兼具殺菌作用,設備廉價等優(yōu)點[4]。微波與熱水浸提法相結合的微波輔助浸提法在米糠多糖[5]等提取上已有應用,提取率比熱水浸提法提高23.5%。而應用微波法及微波輔助浸提法提取灰樹花多糖尚未見報道,本文利用正交法優(yōu)化微波法提取灰樹花多糖的工藝,并將其與常規(guī)的水提醇沉法進行比較。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

灰樹花粉末 (粒度≥100目),由杭州惠松制藥有限公司提供。化學試劑：分析純氯仿、正丁醇、濃硫酸、苯酚等。試驗儀器：MAS-Ⅰ型微波反應器 (上海新儀微波化學科技有限公司);SENCO RE2000型旋轉蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠);JH 754PC型紫外分光光度計 (上海菁華科技儀器有限公司);HH-4型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 (上海森信實驗儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

(1)微波法基本提取工藝。準確稱取灰樹花粉末5.00 g,按設定料液比加入去離子水,充分混合后在一定溫度下進行微波提取,功率700 W。過濾后濾渣按同樣條件重復提取1次,合并提取液。提取液使用Sevag法除去蛋白質,定容后用苯酚-硫酸法測定多糖含量,計算提取率。

(2)葡萄糖標準曲線的制備。準確稱取干燥的葡萄糖1.00 g,定容于100 mL容量瓶中,濃度為10.0 mg/mL(A),備用;移取1.0 mL A溶液于100 mL容量瓶中,定容,濃度為0.1 mg/mL(B),分別準確移取0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5 mL B溶液于8個10 mL容量瓶中,定容。然后分別準確移取2.0 mL于8個25 mL顯色管中,分別加入6%苯酚溶液1.0 mL,混勻,迅速加入5.0 mL濃硫酸,混勻,40℃水浴30 min,取出冷卻,以1號樣品為參比溶液,于490 nm波長下測吸光度,平行測3次,取平均值。以吸收度Y對葡萄糖含量X(μ g/mL)回歸,得回歸方程：

(3)灰樹花多糖測定計算方法。

(4)單因子試驗。工藝優(yōu)化主要是針對提取時間、料液比和提取溫度這3個主要因子,分別在其他因子條件相同的情況下進行單個因子試驗,考察各單因子對灰樹花多糖得率的影響,以選擇最佳的提取工藝條件。

(5)工藝參數(shù)正交設計。為進一步優(yōu)化灰樹花多糖的提取條件,以灰樹花多糖提取率為考核指標,根據(jù)單因子試驗的結果,對提取時間、料液比和提取溫度作正交設計L9(34),進行優(yōu)化試驗。試驗設計的因子水平見表1。

表1 微波法正交試驗設計因子與水平表

(6)提取效果評價。以最常用的水提醇沉法工藝作為對照進行評價。

2 結果與分析

2.1 單因子試驗

(1)提取時間對提取率的影響。提取時間對多糖提取率的影響如圖1所示,多糖提取率在提取15 min時達最大值,說明多糖的浸出多少與時間密切相關。時間過短,灰樹花菌體破裂不完全,產(chǎn)物溶解不充分;時間過長,多糖在持續(xù)的加熱過程中出現(xiàn)分解,提取率下降。因此,微波處理時間宜為15 min。

圖1 提取時間對多糖提取率的影響

(2)料液比對提取率的影響。料液比對多糖提取率的影響如圖2所示,隨著提取介質的增多,灰樹花多糖提取率不斷增高,并在料液比為1∶25(g?mL-1)時達到最大,隨后下降。

圖2 料液比對多糖提取率的影響

(3)提取溫度對提取率的影響。如圖3所示,多糖的提取率隨溫度的升高而增加,90℃時達到最大值,但在超過90℃后多糖提取率趨于平穩(wěn)并呈下降趨勢。說明提取溫度升高,使提取時可被吸收轉換的能量增加,促進了多糖分子的溶解和擴散;而溫度過高,又會導致部分多糖水解,使提取率下降,這與大多數(shù)多糖提取工藝研究的結果相一致。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響

2.2 正交設計試驗

為明確3個提取因子之間的相互作用對多糖提取率的影響,在單因子試驗的基礎上,以灰樹花多糖提取率為考核指標,采用正交設計L9(34)進行優(yōu)化試驗。試驗數(shù)據(jù)由正交設計助手II V3.1專業(yè)版進行處理。正交試驗結果見表2,方差分析結果見表3：各因子對灰樹花多糖提取率影響大小為B＞A＞C,即料液比＞提取時間＞提取溫度。由此可以確定提取率的最佳因素水平組合為：A2B3C2,即提取時間15 min,料液比1∶40,提取溫度90℃。在此條件下重復試驗3次,其多糖提取率分別為：3.816%,3.681%,3.705%,平均提取得率為3.731%。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

2.3 提取效果

將微波法提取灰樹花多糖的最佳工藝與常見的熱水浸提工藝進行比較,微波法具有明顯優(yōu)勢。一是在提取條件方面,兩者均為常壓、溫度90℃、料液比1∶40,但提取時間熱水浸提需6 h,而微波法僅需15 min×2次,共30 min;二是灰樹花多糖提取率,熱水浸提法為1.412%,而微波法達3.731%。

3 結論

將微波法的提取條件通過正交法進行優(yōu)化,得出最佳提取條件為提取時間15 min,料液比1∶40,提取溫度90℃,提取2次,在此條件下灰樹花多糖的平均提取率為3.731%。

微波法與傳統(tǒng)常用的各類水提法相比,常壓情況下花費時間較少,能耗少,提取率較高,是較佳的灰樹花多糖提取方法。

[1]李 磊,王衛(wèi)國,郭彥亮,等.灰樹花多糖的制備及其生物活性研究進展 [J].食品工業(yè)科技,2009,11(30)：327-331.

[2]李小定,榮建華,吳謀成.灰樹花多糖藥理研究進展 [J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2003,15(4)：364-368.

[3]Pare J R J.Microwave-assisted natural products extraction[P].U.S.Patent,o：5002784.1991.

[4]許曉菁,聞建平.微波協(xié)助萃取技術在現(xiàn)代化中草藥生產(chǎn)中的應用 [J].中草藥,2002,33(12)：1141-1143.

[5]朱黎萍,劉友明,李 斌.微波輔助浸提米糠多糖工藝研究[J].糧食與油脂,2005,12：24-26.