ITP患者脾切除前后外周血Th亞群細胞因子的變化及意義*

王 俊， 鄭 冬， 張瓏涓， 鄭朝旭△

(中山大學附屬第一醫院1微創外科，2血液內科，3外科實驗室，廣東廣州510080)

原發性免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)，原稱特發性血小板減少性紫癜，是以抗血小板自身抗體介導的自身血小板在脾臟、肝臟、骨髓等單核巨噬細胞系統中破壞增多為特征的一種自身免疫性出血性疾病。ITP的發病機制尚未完全闡明，近年來不少研究表明除體液免疫機制外，細胞免疫機制不容忽視，其中活化的CD4+T淋巴細胞及其產生的細胞因子的平衡紊亂發揮著重要作用［1］。目前ITP患者的治療首選糖皮質激素，但60%～70%患者激素治療療效欠佳。

脾臟是抗血小板自身抗體產生和血小板破壞的主要場所，脾切除術可以減少血小板自身抗體的產生以及血小板破壞，能迅速提升血小板，緩解病情，是治療激素依賴型和激素無效型ITP的“金標準”。但目前脾切除術治療ITP患者的細胞免疫功能狀態的改變還不是很清楚。CD4+T淋巴細胞即輔助性T淋巴細胞(T helper lymphocyte，Th)，是人體免疫防御機制的核心環節，可通過分泌多種細胞因子進行免疫調控作用。國內外文獻關于ITP患者脾切除治療前后的Th亞群細胞因子的改變僅見個案報道［2］。本研究采用基于Luminex液相芯片技術的Quanti-Gene Plex(QGP)方法，檢測脾切除術前后ITP患者和健康志愿者外周血Th1［白細胞介素－2(interleukin－2，IL－2)和干擾素 γ(interferon γ，TFN －γ)］、Th2(IL－4、IL－5、IL－6和 IL－10)、Th3［轉化生長因子 β1(transforming growth factorβ1，TGF－β1)］和Th17(IL－17)細胞因子mRNA表達水平的差異，探討Th亞群細胞因子在ITP發病中的作用及脾切除術對Th亞群細胞因子功能狀態的影響。

材料和方法

1 材料

1．1 研究對象 選擇2009年4月～2011年6月入住中山大學附屬第一醫院微創外科成功完成腹腔鏡脾切除術的ITP患者22例，男8例，女14例，中位年齡34(10～63)歲。所有ITP患者的診斷標準參照英國血液學學會發表的關于ITP的診斷標準［3］，所有患者初診時血小板計數均＜100×109/L，經骨髓穿刺檢查骨髓像符合ITP表現，并排除其它繼發性血小板減少性疾病。術前所有患者均經過正規足量激素治療。ITP患者脾切除術適應證為激素無效型和激素依賴型患者。健康體檢者30例作為對照組，男18例，女12例，中位年齡43(25～82)歲。實驗經本院倫理委員會審批通過，標本收集前均簽署本人知情同意書。

1．2 主要儀器和試劑 Luminex 200檢測平臺(Luminex)、渦旋混合器(科學儀器股份有限公司)、Labnet溫浴搖床(LabNet)、微孔板離心機(Eppendorf 5804R，Eppendoff)、微量離心機(Eppendorf 5415D，Eppendoff)、磁力架(Affymetrix);QuantiGene Plex 2．0試劑盒(Affymetrix);目的基因(IL－2、IFN －γ、IL－4、IL－5、IL－6、IL－10、TGF－β1和 IL－17)和管家基因(PPIB和β－actin)的探針均由Affymetrix公司設計并合成。

2 方法

2．1 標本采集 在ITP患者脾切除術前3 d及術后7 d，清晨空腹抽取外周靜脈血2 mL，放入含有枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中，收集靜置后直接放入－80℃冰箱中凍存備用，集中檢測。對照組采血及保存方法同ITP患者。

2．2 QGP檢測目的基因mRNA表達 應用QGP方法同時檢測外周血8個細胞因子(IL－2、IFN－γ、IL－4、IL－5、IL －6、IL －10、TGF－β1和 IL －17)mRNA表達水平，實驗操作嚴格按照說明書要求進行。使用QuantiGene plex 2．0樣本處理試劑盒中的裂解液將全血樣本裂解，使總RNA釋放出來。然后將裂解后的樣品分別加入96孔板的每個孔中，每孔加80 μL，并在每個孔中加入20μL稀釋的探針磁珠試劑，然后將96孔板放入Labnet溫浴搖床中54℃過夜雜交(18 h)。將雜交過夜后的混合物轉移至固定于磁力架上的磁性分離板，用緩沖液洗滌3次，按步驟依次加入按比例稀釋的Pre－Amplifier、Amplifier、Label probe，每一步完成后放入恒溫搖床雜交1 h，溫度控制在(50．0±0．5)℃，緩沖液洗滌3次，信號逐層放大。最后加入熒光底物，常溫染色30 min，最后通過Luminex 200檢測平臺檢測相對信號強度。以βactin為內參照，目的基因的檢測值與β－actin的檢測值相比之后得到的相對定量信號值作為該目的基因mRNA的相對表達水平。

3 統計學處理

采用SPSS 13．0 for Windows統計軟件包(SPSS Inc)進行統計分析。計量資料用均數±標準差(ˉx±s)表示。一般資料中年齡比較應用t檢驗，性別比較應用χ2檢驗。術前和術后的數據的比較應用配對資料的符號秩檢驗(Wilcoxon signed rank test)，術前和對照組、術后和對照組的數據比較應用兩獨立樣本的秩和檢驗(Wilcoxon rank sum test)。細胞因子之間的相關性分析采用Spearman等級相關方法。以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 一般資料比較

如表1所示，ITP患者與健康對照組之間的年齡及性別比構成差異均無統計學意義(P＞0．05)。

2 外周血Th1、Th2、Th3和Th17細胞因子的mRNA表達水平變化

2．1 Th1細胞因子 術前組外周血IL－2 mRNA水平顯著低于對照組(P＜0．05);術后組IL－2 mRNA水平明顯高于術前組(P＜0．05)，但仍低于正常對照組(P＜0．05)，見圖1A。對照組、術前組和術后組外周血IFN－γmRNA水平的差異均無統計學意義(P＞0．05)，見圖1B。

表1 ITP組和健康對照組之間的一般資料比較Table 1．Comparison of clinical data in ITPpatients and controls

Figure 1．The mRNA expression changes of Th cytokines in ITPpatients before splenectomy(Pre－op)and after splenectomy(Postop)．A:IL－2;B:IFN－γ;C:TGF－β1;D:IL－17．ˉx±s．control:n=30;Pre－op:n=22;Post－op:n=22．*P＜0．05 vs control;△P ＜0．05 vs Pre－op．圖1 ITP患者脾切除術前后Th細胞因子mRNA相對表達水平的變化

2．2 Th2細胞因子 對照組、術前組和術后組外周血Th2細胞因子(IL－4、IL－5、IL－6和 IL－10)mRNA表達水平均非常低，基本低于試劑盒的檢測范圍下限。

2．3 Th3細胞因子 術前組和對照組之間TGF－β1mRNA水平差異無統計學意義(P＞0．05);術后組TGF－β1mRNA水平顯著高于術前組及對照組(P＜0．05)，見圖1C。

2．4 Th17細胞因子 術前組IL－17 mRNA水平顯著高于對照組(P＜0．05);術后組IL－17 mRNA水平與術前組之間的差異無統計學意義(P＞0．05)，但術后組的IL－17 mRNA水平仍明顯高于對照組(P ＜0．05)，見圖1D。

3 ITP患者細胞因子之間的相關性

對術前和術后4種細胞因子(IL－2、IFN－γ、TGF－β、IL－17)mRNA相對表達量之間進行相關性分析。如表3所示，ITP患者術前IL－2與IFN－γ之間呈正相關(r=0．647，P ＜0．01)，其它細胞因子之間均無明顯相關性(P＞0．05)。

表3 術前ITP患者的細胞因子mRNA表達水平之間的相關性分析Table 3．Correlations between cytokine mRNA expression in ITP preoperative patients

ITP患者術后3對細胞因子之間呈正相關，分別是 IL－2與IFN －γ(r=0．787，P ＜0．01)，IL－2與IL－17(r=0．554，P ＜0．01)，IFN －γ 與 IL －17(r=0．461，P ＜0．05);其它細胞因子之間均無明顯相關性(P ＞0．05)，見表4。

表4 術后ITP患者的細胞因子mRNA表達水平之間的相關性分析Table 4．Correlations between cytokine mRNA expression in ITP postoperative patients

討 論

ITP是一種自身免疫性的器官特異性血液病，主要是由于抗血小板自身抗體介導的血小板破壞或者血小板生成受損所導致。自身反應性B淋巴細胞分泌自身抗體被認為是經典的ITP發病機制，但是B細胞產生抗體需要特異性自身反應性T細胞的輔助。因此，活化的CD4+Th細胞及其產生的細胞因子失衡在ITP發病中的作用越來越受到重視。本團隊前期研究初步發現了ITP患者的外周血T細胞亞群(主要是CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞)存在異常以及脾臟細胞免疫存在異常［4－5］。為進一步深入研究ITP患者CD4+T淋巴細胞(Th)分泌的細胞因子的功能狀態及脾切除術對細胞因子的影響，我們檢測了脾切除術前后外周血CD4+T淋巴細胞分泌的8種主要細胞因子mRNA表達情況。

CD4+Th淋巴細胞根據分泌細胞因子種類的不同，通常可以分為3個細胞亞群:Th1、Th2和Th3亞群。Th1細胞主要是產生IL－2和IFN－γ等細胞因子，參與巨噬細胞活化過程，介導細胞免疫;而Th2細胞主要是產生IL－4、IL－5、IL－6和IL－10等細胞因子，誘導抗體生成，介導體液免疫。Th3細胞主要通過分泌免疫調節因子TGF－β1，下調抗原提呈細胞，其功能與免疫耐受誘導密切相關。最近發現的一種新的效應性CD4+T細胞亞群，以分泌IL－17為特征，因此被命名為Th17細胞，已發現其在防御胞外菌感染、介導慢性炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤發病中發揮重要作用。

正常情況下，Th1和Th2細胞亞群的平衡對調節免疫系統是非常必要的，多種自身免疫性疾病均存在Th1/Th2細胞亞群比例的失衡。多數研究表明ITP主要表現為Th1細胞占優勢和Th1細胞因子活化模式［6－7］，也有研究者持中立態度［8］或反對這種觀點［9］。而在本研究中，術前ITP患者IL－2 mRNA表達水平較對照組下降，提示ITP的發病可能與Th1細胞因子被抑制有關。經過脾切除后，IL－2 mRNA水平有所升高，但仍低于正常對照組，說明經過手術治療，機體的免疫功能有所恢復，但IL－2尚未完全恢復至正常水平。Andersson等［8］應用 ELISA方法檢測ITP患者和健康對照組的血清細胞因子水平，發現兩組IL－2、IFN－γ和IL－4表達水平均無法檢測出，低于試劑盒的檢測下限，這與本研究的部分結果有一定相似性。

Th3細胞因子TGF－β1被認為是B細胞增殖和抗體分泌的一個重要的抑制因子，且TGF－β1還可抑制T細胞增殖及阻止Th1和Th2細胞介導的自身免疫性疾病的發生。Gorelik等［10］發現TGF－β1是維持自身免疫系統穩定的一個關鍵負調節者，TGF－β1的減少導致自身免疫反應的激活。Andersson等［8］發現慢性ITP緩解期患者相對于活動期患者和健康對照組TGF－β1的表達水平更高，認為TGF－β1在疾病緩解期介導的旁路免疫抑制效應可能發揮重要作用。他們隨后的研究又發現ITP患者活動期外周血單個核細胞(PBMC)生成TGF－β1減少［11］。Fahim等［12］報道，急性和慢性ITP患者TGF－β1mRNA表達水平均明顯低于正常對照組，慢性ITP活動期患者的TGF－β1mRNA水平顯著低于緩解期患者。這些研究結果提示，慢性ITP活動期可能與Th3反應的下調有關，而病情緩解可能是由于Th3反應上調所引起。本研究對象均為經過正規足量激素治療的慢性患者，術前病情已經得到部分緩解。檢測結果發現，術前組TGF－β1mRNA表達水平與正常對照組無顯著差異，與上述研究結果基本吻合。術后患者TGF－β1mRNA水平較術前組及對照組均明顯升高，提示脾切除術可上調TGF－β1基因表達水平，發揮旁路免疫抑制效應，激活Th3反應，從而進一步使患者病情得到緩解。

研究發現，Th17細胞可介導多種自身免疫性疾病，包括實驗性自身免疫性腦脊髓炎、膠原誘導性關節炎、炎癥性腸病等，而這些疾病過去都被認為主要是由Th1細胞及其產生的細胞因子所介導。此外，有越來越多的研究將焦點放在明確Th17細胞在器官特異性疾病的發病機制中所起的作用;已有研究證明Th17細胞比Th1細胞在誘導自身免疫性疾病方面更有效也更有影響力。細胞因子IL－17也被發現在人類多種自身免疫性疾病中是增高的，包括類風濕關節炎、多發性硬化癥和銀屑病等。而IL－17與ITP的相關研究較少，且得出的結論存在不統一。Guo等［13］和 Ma等［14］研究認為 ITP 的發病與 IL －17無明顯關系;而 Wang 等［15］和 Rocha 等［16］研究發現ITP患者血清IL－17蛋白水平升高。本研究結果顯示，ITP患者術前和術后的IL－17 mRNA表達水平均較對照組升高，但術前和術后無顯著差異，提示IL－17在ITP發病中可能具有非常重要的作用，但脾切除治療短時間內并不能下調IL－17 mRNA表達水平。

本研究對ITP患者術前和術后4種細胞因子(IL－2、IFN－γ、TGF－β和IL－17)之間的相關性進行分析，發現術前和術后IL－2和IFN－γ均成正相關，可能是由于Th1細胞因子之間存在協同作用。術后ITP患者的IL－17與IFN－γ、IL－2之間均成正相關，提示ITP患者的Th1和Th17細胞因子之間可能也存在相互影響的作用。

目前多采用RT－PCR傳統方法檢測基因mRNA表達水平，但由于步驟繁瑣、易受干擾等因素等影響了檢測結果的準確性。mRNA表達的準確性和敏感性對于基因研究尤為重要，所以本研究選擇采用基于b－DNA技術和Luminex液相芯片技術的QuantiGene Plex(QGP)方法。其優勢是直接從全血樣本中檢測目的基因表達，而且可在同一反應孔中同時對多個基因進行精確定量。它無需抽提純化、無需逆轉錄、無需PCR擴增，只需要簡單的細胞溶解過程，經探針雜交與信號放大即可快速得到比RTPCR更加精確的定量結果，因而避免了很多人為因素對實驗的干擾。實踐證明，QGP技術在精確度、準確性、重現性等方面均優于RT－PCR，并且與RTPCR有良好的相關性［17］。提示QGP技術可以作為檢測基因表達水平的高通量、多樣本的手段，可應用于臨床和實驗研究。目前國內外尚未見到將QGP技術應用于ITP研究中的報道。

總之，本研究發現，手術前ITP患者IL－2表達較正常對照明顯降低，IL－17表達較正常對照明顯上升，而IFN－γ和TGF－β1較正常對照無明顯差別。脾切除術治療后，TGF－β1表達較治療前明顯升高;IL－2表達較治療前有所升高，但仍低于正常對照;而IFN－γ和IL－17較治療前無明顯差別。本研究表明，ITP患者存在Th亞群細胞因子表達失衡，脾切除術治療作為激素依賴或無效的ITP患者的有效手段，可改善ITP患者部分Th亞群細胞因子的失衡。

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