酸性成纖維細胞生長因子復方保存液對大鼠肝臟低溫保存的作用*

許 華， 蘇本金， 江海香， 黃亞東

(暨南大學1藥學院，2醫藥生物技術研究開發中心，廣東廣州510632)

原發性移植物無功能(delayed graft function，DGF)一直是器官移植界多年來未能解決的問題。近年來，有學者發現器官在體外低溫保存期間失去了正常存在于血漿中的營養因子(trophic factors，TFs)對細胞的營養和支持作用，這可能與DGF的發生有關［1］。此后，新型營養因子保存液逐漸成為器官保存液研制的一個熱門方向［2－3］。酸性成纖維細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)作為營養因子的重要成員，具有創傷修復、神經調節、神經保護和內臟保護等活性，對缺血再灌注臟器起到很好的保護效果［4－5］。本研究采用低溫保存模型，以臨床常用的高滲枸櫞酸鹽腺嘌呤(hypertonic citrate adenine，HCA)溶液作為對照，研究aFGF對供肝的保存效果。

材料和方法

1 藥品與溶液的配制

重組人 aFGF14－154，濃度為 0．126 g/L，比活性 8．3 × 108U/L，由暨南大學醫藥生物技術研究開發中心研制。HCA液，配方為 K+80 mmol/L，Na+80 mmol/L，MgSO441 mmol/L，枸櫞酸55 mmol/L，腺嘌呤 0．38 mmol/L，甘露醇 30 g/L，pH 值7．0 ± 0．1，滲透壓為380 mOsm/L。aFGF復方保存液，即在HCA保存液中加入aFGF14－15440μg/L。考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue，CBB)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品。

2 動物與分組

健康雄性Wistar大鼠24只，體重180～200 g，清潔級動物，購自中山大學醫學院實驗動物中心。隨機分為單純HCA保存液組(對照組)和aFGF復方保存液組(實驗組)，每組12只;根據離體肝臟保存的不同時間，再分為2個亞組，每組6只。

3 大鼠離體肝臟單純低溫保存模型的制備

實驗前大鼠禁食不禁水12 h，實驗時用10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定。手術，游離左腎靜脈水平以下的腹主動脈結扎阻斷，在腎臟動脈下方1．5 cm處的腹主動脈插入留置針并固定，利用三通注射含100 U肝素生理鹽水1 mL，完畢后開始灌注單純HCA液或aFGF復方保存液。灌注液置于低溫4℃條件下保存，按12 mL/min流速灌注。開始灌注的同時手術線阻斷腹腔動脈以上的腹主動脈，并迅速剪開肝上、下的下腔靜脈，讓灌洗液順利流出，約5 min，使肝臟呈現質地均勻土黃色。切取供肝吸干稱重后置于4℃等體積的保存液中。

4 觀察指標

4．1 肝臟保存前后重量差 計算公式為:肝臟重量差(g)=保存后肝重量(g)－保存前肝重量(g)。

4．2 生化指標 供肝保存12和24 h后，分別取肝臟保存液2 mL于－80℃冰箱中，待測ALT和AST含量;分別取肝中葉組織1 g置于－80℃冰箱，待實驗完成后同批測定MDA含量。

4．3 組織病理學變化 取肝中葉組織約1．0 cm ×0．5 cm×0．5 cm投入20倍于肝體積的4%多聚甲醛溶液中固定，常規脫水、透明、石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下觀察。

5 統計學處理

用SPSS統計軟件包進行分析，數據用均數±標準差(ˉx±s)表示，組間比較使用t檢驗。以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同時間保存后肝臟重量的變化

肝臟的重量隨保存時間延長而增加。在12 h保存時點，2組肝臟的重量差無顯著差異(P＞0．05)，而在24 h保存時點，實驗組肝臟重量差為(0．79±0．20)g，明顯低于對照組肝臟重量差［(1．10±0．40)g］，2組間比較差異顯著(P ＜0.05)，見圖1。

Figure 1．Changes of liver weight difference after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA or aFGF compound solution．ˉx±s．n=6．*P＜0．05 vs HCA group．圖1 各組大鼠肝臟重量的變化

2 不同保存時間后保存液中ALT和AST活性的變化

保存液中ALT和AST變化見表1。在12 h時點，實驗組ALT活性明顯低于對照組，2組間比較差異顯著(P＜0．05);在24 h時點，實驗組ALT和AST活性與對照組相比差異顯著(P＜0．05)，且實驗組 ALT明顯低于對照組(P ＜0．01)。這表明實驗組的肝損害程度明顯低于對照組，即aFGF對所保存供肝具有一定的保護作用。

表1 各組大鼠肝臟ALT和AST活性的比較Table 1．The activity of ALT and AST after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA solution or aFGF compound solution(103 U/g．ˉx±s．n=6)

3 保存后不同時點肝臟組織中MDA含量的變化

肝臟在2種保存液中4℃保存12 h后，其MDA含量無顯著差異(P＞0．05)，而在24 h保存時點，實驗組MDA含量明顯低于對照組 (P＜0．05)，見圖2。

Figure 2．Content of MDA after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA or aFGF compound solution．ˉx±s．n=6．*P ＜0．05 vs HCA group．圖2 各組大鼠肝臟MDA含量的變化

4 不同時點保存后肝臟組織病理學改變

肝臟保存12 h后，HCA組肝小葉中央靜脈周圍有肝細胞腫脹、細胞核固縮、胞漿深染等變化，見圖3A;而實驗組肝細胞連接相對緊密，肝索排列有序，見圖3B。24 h時對照組肝組織水腫嚴重，細胞破碎排列松散，嗜酸性增強，核深染固縮，見圖3C;而實驗組肝細胞仍能維持較完整的形態，見圖3D。

Figure 3．Morphological changes of liver after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA or aFGF compound group(HE staining，×400)．A:12 h in HCA group;B:12 h in aFGF compound group;C:24 h in HCA group;D:24 h in aFGF compound group．圖3 各組大鼠肝臟HE染色結果

討 論

已有的實驗表明，生物營養因子具有顯著減輕多種離體臟器冷缺血的損傷。McAnulty等［2］首次在UW保存液中補充了多種生物營養因子，包括表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、胰島素樣生長因子(insulin － like growth factor，IGF－1)和神經生長因子(nerve growth factor，NGF)等對狗進行腎臟移植實驗，結果顯示，營養因子添加組顯著改善了低溫腎臟保存的質量和持久性，能實質性地防止冷缺血損傷。隨后，在其它的器官移植的研究中，研究者發現營養因子同樣對肝臟、心臟保存起到很好的保存作用［6－7］。aFGF作為生物營養因子重要成員之一，與其它生物營養因子NGF、EGF、IGF相比，具有促進細胞增殖、分化，促進新生血管形成，促進創傷愈合與組織修復、再生并參與神經再生等廣泛的生物活性。但尚未見將aFGF用于器官保存液的研究報道。

本研究通過觀察HCA保存液和aFGF復方保存液對大鼠肝臟的保存作用，探討了aFGF對肝臟低溫保存效果的影響。結果表明，HCA對照組在肝臟保存12 h具有良好的肝臟保護效果，但24 h時肝臟發生較明顯的水腫，可能是因為長時間低溫冷凍保存抑制了細胞膜上離子泵的活性，導致細胞膜通透性增高，引起離子紊亂，以致HCA液易發生細胞的水腫［8］。多器官保存液HCA中加入aFGF，可明顯改善原HCA液對肝臟的冷藏保存效果。aFGF復方保存液組肝重量差減小，表明aFGF可拮抗隨保存時間延長而出現的肝臟水腫的不斷增加，這可能是aFGF參與了細胞張力調節，影響細胞鈣離子濃度平衡，抑制細胞發生腫脹，保護了細胞膜［9］。

氧自由基在缺血缺氧時可加強脂質過氧化反應，損傷細胞膜，以及線粒體功能障礙，造成細胞損傷和死亡［10］。aFGF復方保存液組MDA含量較HCA組顯著降低，表明aFGF具有一定的抗氧化損傷作用，可能是aFGF的非促分裂活性，即神經和血管保護作用、激素樣特性等，保護細胞膜免受冷保存時細胞自由基水平升高所致的損傷［11－13］。aFGF復方保存液組肝灌洗液中ALT和AST活性比對照組下降更為顯著，進一步驗證了aFGF對肝細胞的保護作用，具有降低組織損傷或壞死的作用［14］。以上結果表明，aFGF復方保存液具有減輕肝損傷的作用，其機制可能是:(1)抑制細胞腫脹;(2)拮抗氧自由基的損傷，從而減輕肝損傷。因此，aFGF彌補了HCA液易發生細胞的水腫和對無氧自由基清除能力不足的缺陷，兩者產生了互補和(或)協同作用。

綜上所述，在HCA保存液中加入aFGF，在一定程度上減輕了大鼠肝臟灌注及冷保存所致肝細胞損傷，其機制可能與aFGF抑制肝細胞腫脹及拮抗自由基損傷雙重作用有關。能否將aFGF等一系列的營養因子作為臨床器官保存液的常規添加劑、加入多大濃度的aFGF更合適、常用器官保存液配方對aFGF作用的影響等問題，值得進一步研究。

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