人工老化誘導的油菜種子活力和抗氧化酶活性變化的研究

曾欽薇，謝永俊

（1.云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101；2.云南省農業科學院經濟作物研究所，云南昆明650205）

植物種子長期貯存期間活力將逐漸喪失，但老化的速率因植物種類而異[1]。老化原因及其抗衰老機制國內外已作了一些研究。老化期間，種子產生大量活性氧中間體（reactive oxygen species，ROS），ROS導致脂質過氧化[2]，丙二醛（MDA）則是脂質過氧化的產物，其含量的高低在一定程度上反映了膜脂過氧化的水平[3]。大量研究表明，自由基是種子老化的主要原因，它導致脂質過氧化，對細胞膜結構的完整性和功能造成巨大傷害，使種子活力衰退。種子擁有包括自由基和過氧化物清除酶在內的一些保護機制，這些酶如過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）和超氧化物歧化酶（SOD）[2，4]。以向日葵為例，種子的老化與去氧化酶活性的降低和脂質過氧化密切相關[5]。研究還表明，種子高含水量和高溫將進一步加速種子衰老[6]。

甘藍型油菜（Brassica napus L.）是中國重要的油料作物，在開花前期和成熟期遭受高溫脅迫將影響種子產量和質量[7]。鑒于油菜種子含有較多的脂肪，貯存期間脂質可能更易被過氧化，進而加速種子活力衰退，本研究通過高溫高濕處理加速新鮮油菜種子老化，測定其活力、抗氧化酶活性和MDA含量等的變化，進一步探討種子活力衰退的生理生化機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

電熱恒溫水浴鍋（HHS型，上海博訊），電導儀（JEY-45001，Jenway，UK），梅特勒XS105DU電子天平（瑞士），高速冷凍離心機（Eppendorf centrifuge 5810R，Germany），雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901，北京普析）。

1.2 油菜種子

產自云南省彌勒縣的甘藍型油菜新鮮種子，品種為花油7號。

1.3 種子老化處理

參考Parrish and Leopid方法[8]，稍作改進。每個處理選取100粒飽滿的種子，加5%次氯酸鈉溶液渦旋消毒3 min，去離子水漂洗3次，用濾紙吸干；轉入平皿，攤平，置45℃水浴，水浴鍋加蓋密封（使相對濕度保持100%）。老化處理1 d、2 d、3 d，測定各生理指標。

1.4 測定方法

1.4.1 種子發芽指數、活力指數、發芽率和發芽速率測定

采用GB/T3543.4-1995技術規范測定種子發芽率、發芽指數、活力指數和發芽速率[9]。老化時間分別為0 d（CK）、2 d、4 d、6 d，3個重復，每個處理50粒種子。發芽指數（GI）=∑（Gt/Dt），活力指數（VI）=GI×S，發芽率（%）=發芽終期全部正常種苗數/供試種子數×100，發芽速率（日）=∑（Gt×Dt）/發芽率。式中，Gt為每天的發芽粒數，Dt為相應發芽日數，S為觀察結束時幼苗長度（根長+莖長，cm）。

1.4.2 種子相對電導率的測定

種子發生劣變時，細胞膜結構和功能完整性受到傷害，質膜透性增加。透性增加將使種子向周圍介質溶液滲漏出較多的電解質，使溶液電導率增加，電導率的高低則反映出種子質膜的受損程度，受損越嚴重，種子活力越低。仿Zhang等方法[10]，并適當改進。取經不同時間[0 d（CK）、1 d、2 d、3 d]加速老化處理的5粒種子放入盛有5 ml去離子水的具塞試管內，置于25℃/120 rpm搖床振蕩1 h，測定初電導率（ECi）；試管轉入100℃沸水浴中加熱10 min，流水冷卻到室溫，測定終電導率（ECt）。以ECi/ECt表示相對電導率。3個重復。

1.4.3 MDA測定

參照Dhindsa等硫代巴比妥酸法[11]。3個重復。

1.4.4 POD、SOD和CAT活性測定

采用陳建勛等方法[12]測定CAT、POD和SOD活性。3個重復。

1.5 統計分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 老化處理對油菜種子發芽指數、活力指數、發芽率和發芽速率的影響

從表1可見，油菜種子的發芽指數、活力指數、發芽率和發芽速率隨著老化時間的延長而降低，前3個指數各老化時間之間及其與對照組之間差異極顯著（p＜0.01）。發芽速率與對照組差異也極顯著（p＜0.01）。顯然，加速老化使油菜種子的活力大大降低。

表1 老化處理油菜種子的發芽指數、活力指數、發芽率和發芽速率（n=3）

表1 老化處理油菜種子的發芽指數、活力指數、發芽率和發芽速率（n=3）

項目 老化時間(d)0（CK）1 2 3發芽指數 41.5±8.6A 20.4±5.7B 13.2±3.4C 1.1±0.3D活力指數 256.9±33.4A 67.7±13.6B 28.8±9.3C 2.8±1.1D發芽率（%）99.7±0.1A 88.1±3.3B 64.8±5.3C 8.2±2.2D發芽速率（日）0.7±0.1A 1.3±0.1B 1.5±0.2C 2.1±0.2D

表2 老化處理對油菜種子的相對電導率和生化指標的影響（，n=3）

表2 老化處理對油菜種子的相對電導率和生化指標的影響（，n=3）

老化時間（d）0（CK）1 2 3相對電導率 0.10±0.03 a 0.12±0.02 ab 0.17±0.05 bc 0.19±0.03 c項目MDA 含量（μmol·g-1）2.32±0.61 a 3.49±1.12 ab 3.68±0.83 ab 5.14±1.90 b POD 活性（U·min-1·g-1FW）186.54±33.43 161.72±21.56 118.85±13.32 67.81±12.11 SOD 活性（U·min-1·g-1FW）135.23±13.19 123.15±11.37 78.78±5.34 53.28±4.92 CAT 活性（U·min-1·g-1FW）151.67±8.13 129.36±15.18 67.52±7.21 42.14±5.62

2.2 老化處理對油菜種子細胞膜完整性的影響

從表2可見，種子滲出液的相對電導率隨著老化時間的延長而增加。方差分析表明，老化2 d、3 d與對照、老化1 d與3 d差異顯著（p＜0.05），但老化1 d與對照、老化2 d與老化3 d差異不顯著（p＞0.05）。顯然，老化時間越長，油菜種子細胞膜的完整性被破壞越大，將降低種子的活力。

表3 老化處理油菜種子活力與各生理指標之間的相關性

2.3 老化處理對油菜種子MDA含量的影響

隨著老化時間的延長，MDA含量呈逐漸上升趨勢（表2）。方差分析表明，老化3 d與對照組差異顯著（p＜0.05），其余各組之間差異不顯著（p＞0.05）。顯然，老化時間越長，油菜種子中的脂質更多地被過氧化，進而加速種子活力衰退。

2.4 老化處理對油菜種子POD、SOD和CAT活性的影響

隨著老化時間的延長，油菜種子中POD、SOD和CAT的活性呈下降趨勢（表2），老化時間越長，與對照的差異越大。顯然，隨著老化時間的延長，種子內上述過氧化物清除酶的活性降低，脂質將更多地被過氧化，使種子活力下降。

2.5 種子活力與上述各生理指標之間的相關性分析

采用SPSS17.0統計軟件進行相關性分析表明，油菜種子活力與相對電導率和MDA含量呈顯著負相關，而與POD、SOD和CAT活性（表3）呈顯著正相關（p＜0.05）。

3 討論

種子中自由基的產生將加速脂質過氧化，并破壞細胞膜結構和功能的完整性。所產生的自由基如果不能被清除，必將因脂質過氧化、細胞膜結構和功能完整性的破壞，使種子老化，活力降低。細胞中產生的超氧化物自由基和膜脂中的不飽和脂肪酸發生過氧化是膜被破壞的原因[3]。因此，種子中的自由基和過氧化物清除酶—SOD、POD、CAT、APX、GR在種子抗衰老中的作用十分重要。SOD催化2分子過氧化物為分子氧和H2O2[13]。CAT、POD、APX與 H2O2清除有關，APX用抗壞血酸作為電子供體將H2O2還原為水[14]，GR通過谷胱甘肽—抗壞血酸氧化還原循環在內生H2O2控制中起作用[15]，而且，抗壞血酸和谷胱甘肽在植物中是重要的抗氧化劑[16]。

在本研究中，加速老化使油菜種子中POD、SOD和CAT活性及質膜的完整性降低，過氧化產物MDA含量增加，外在表現為種子發芽指數、活力指數、發芽率和發芽速率下降。本研究與Afshari等[17]測定的人工老化油菜種子結果相似。POD活性的變化與王煜等[18]測定的自然老化19年的油菜種子的結果相一致。

綜上所述，油菜種子老化期間各種抗氧化酶活性的下降、脂質的過氧化、細胞膜結構和功能完整性的破壞，是其老化和活力衰退的原因。鑒于高溫高濕是誘導種子老化的重要外因，在貯存油菜種子時應將其含水量降至安全范圍，同時要降低貯存溫度，以延長種子壽命。

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