烏頭堿溫敏凝膠的制備及其體外評價

顧玲玲 李俊麗 劉小平 王 蒙 張增偉

武漢理工大學化學工程學院制藥工程系，湖北武漢 430070

烏頭堿溫敏凝膠的制備及其體外評價

顧玲玲 李俊麗 劉小平 王 蒙 張增偉

武漢理工大學化學工程學院制藥工程系，湖北武漢 430070

目的 制備烏頭堿溫敏凝膠制劑，并對其體外釋藥進行考察。 方法 以溫度敏感型材料泊洛沙姆407（P407）為載體材料制備烏頭堿溫敏凝膠制劑，通過正交設計優選出烏頭堿溫敏凝膠的處方工藝。采用恒溫搖床法以磷酸鹽緩沖液（pH=5.80）為釋放介質測定其體外釋放度。 結果 烏頭堿溫敏凝膠的膠凝溫度為36.1℃。96 h體外累積釋放率為89.45%。結論本實驗制備工藝簡單，制得的烏頭堿溫敏凝膠緩釋性能良好，具有較好的應用前景。

烏頭堿；泊洛沙姆407；溫敏凝膠

烏頭堿是C-19二萜類雙酯型生物堿，存在于烏頭屬植物中，是常用中藥川烏、草烏、附子的主要有效成分，具有良好的抗炎鎮痛作用[1]。臨床用于治療風濕、類風濕性關節炎。但烏頭堿毒性大，口服0.2mg即可中毒。其有效劑量跟中毒劑量相近，中毒主要表現在心血管系統、消化系統、呼吸系統及神經系統四方面[2]。因此，其口服制劑在臨床應用上有較大的限制。

近年來，溫度敏感型可注射水凝膠引起了人們極大的關注，這種水凝膠在低于體溫時，以溶液狀態包埋藥物，注射后，由于溫度的變化，溶液迅速轉變為半固體狀凝膠，藥物在擴散作用和凝膠自身降解作用的雙重推動下，從凝膠中平穩地釋放出來，達到緩釋作用[3-5]。風濕、類風濕性關節炎屬于需長期服藥的疾病，烏頭堿溫敏凝膠通過局部注射給藥直接作用于病灶部位，可以降低全身毒副作用，也提高了生物利用度[6-7]。

本實驗結合烏頭堿溫敏凝膠的特性，通過處方篩選，優化設計烏頭堿溫敏凝膠的制備工藝，并對其體外釋放進行考察。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），FA2004電子分析天平（HANGPING，上海精密科學儀器有限公司），HH-S恒溫水浴（鞏義市英峪予華儀器廠），SHA-B電子恒溫搖床（常州國華電器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

烏頭堿（江蘇南京澤朗醫藥科技開發有限公司提供），烏頭堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0720-9406），透明質酸 （武漢市合中生化制造有限公司提供），泊洛沙姆407（德國BASF公司），乙腈（國藥集團化學試劑有限公司，色譜純），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 膠凝溫度的測定

試管倒置法測定：取1mL烏頭堿溫敏凝膠溶液置于10mL試管中，將其置于恒溫水浴中，水浴溫度采用精度為0.1℃的精密溫度計測定，緩慢升溫，升溫速率為0.5℃/min。每升高0.1℃取出試管，根據流動（sol）-不流動（gel）的原則進行判斷，記錄膠凝溫度。

2.2 影響因素考察

2.2.1 pH對烏頭堿穩定性影響 精密稱取烏頭堿對照品5.0mg，置于10mL容量瓶中，用0.5mL 1 mol/L HCl超聲溶解并分別用pH為4.80、5.80、6.80、7.40 PBS緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，即得500μg/mL的標準溶液，分別在25℃和4℃對其穩定性進行考察，以24 h測定其含量為評價指標。pH 4.80和pH 5.80條件下，烏頭堿在25℃和4℃均保持穩定；在pH 6.80條件下，烏頭堿在25℃下有降解，不穩定；在pH 7.40條件下，烏頭堿在25℃和4℃均不穩定。綜合考慮，選擇pH 5.80的緩沖溶液。

2.2.2 P407的濃度對膠凝溫度的影響 用蒸餾水配置濃度為14%、16%、18%、20%的P407溶液，并測定其膠凝溫度。14%濃度下的P407溶液未膠凝，16%、18%、20%的P407溶液的膠凝溫度分別為31.9、28.3、25.9℃。結果表明，P407的膠凝溫度具有濃度依賴性，調節P407的濃度可以得到適宜的膠凝溫度。

2.2.3 甘油濃度對膠凝溫度的影響 用蒸餾水配置三組15%的P407溶液，分別含有5%、10%、15%的甘油，并測定其膠凝溫度。其膠凝溫度分別為38.6、32.6、22.7℃。結果表明，15%P407溶液不能完全膠凝，當加入甘油時，能使其膠凝，且膠凝溫度隨甘油濃度的升高而降低。

2.2.4 1 ，2-丙二醇的濃度對膠凝溫度的影響 用蒸餾水配置三組15%的P407溶液，分別含有10%、15%、20%的1，2-丙二醇，并測定其膠凝溫度。其膠凝溫度分別為40.9℃、36.5℃、31.6℃。結果表明，15%P407的膠凝溫度隨1，2-丙二醇濃度的升高而降低。

2.2.5 透明質酸的濃度對溶液黏連性的影響 用蒸餾水配置三組15%P407溶液，分別含有0.10%、0.20%、0.30%的透明質酸，并觀察其粘連性，質量分數大于0.30%透明質酸溶液粘連。

2.2.6 加入藥物對膠凝溫度的影響 用PBS（pH=5.80）配置兩組15%P407溶液，一組不加烏頭堿，另一組加有烏頭堿，觀察是否膠凝。不加烏頭堿組不膠凝，加入烏頭堿組在33.0℃條件下膠凝。

2.3 正交試驗設計

通過預試驗中單因素試驗結果，選擇甘油濃度（A）、1，2-丙二醇濃度（B）、透明質酸濃度（C）、P407 濃度（D）為考察因素，以膠凝溫度（T）為評價指標（評分方法[8]：由于人體的正常體溫范圍為36～37℃，故選擇膠凝溫度在此范圍內者得5分，每低于36℃或高于37℃為1℃者扣0.25分）。

表1 L9（34）處方正交設計因素水平（%）

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

評分結果顯示：各因素對評分的影響為D＞B＞C＞A，方差分析結果顯示，P407的濃度對實驗有顯著性影響。烏頭堿溫敏凝膠的最優處方為：A2B3C2D1。即甘油10%，1，2-丙二醇17%，透明質酸0.20%，P407 14.2%。

2.4 烏頭堿溫敏凝膠的制備

精密稱取1.420 0 g P407于燒杯中，加入適量4℃pH 5.80 PBS緩沖液中，自然溶脹，24 h的澄清溶液。將1.000 0 g甘油、1.700 0 g 1，2-丙二醇、0.020 0 g透明質酸加入溫敏溶液基質中，攪勻，再加入0.005 0 g烏頭堿，超聲。

2.5 烏頭堿溫敏凝膠體外釋放度的考察

2.5.1 測定方法 色譜條件[9]為色譜柱：Elite-C18柱（填料：Hypersil ODS2，粒度：5 μm，規格：4.6 mm×250.0 mm）；流動相：0.1%甲酸-乙腈（40∶60）；檢測波長：235 nm；流速：1.00mL/min；柱溫：35℃；進樣量：20 μL。

2.5.2 標準曲線的繪制 精密稱取烏頭堿對照品5mg，用0.5mL 1 mol/L的 HCl溶液超聲溶解，加 PBS（pH=5.80）定容至10 mL。 分別量取 0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mL 配制成 4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL 的對照品溶液，經過 0.45 μm 微孔濾膜過濾后進行色譜分析，對吸收峰面積（A）與烏頭堿對照品濃度（C）進行線性回歸得到標準曲線方程：Y=22.629C-0.246，r=0.999 7。結果表明烏頭堿在4.0～20.0μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5.3 專屬性試驗 按上法配制濃度為80μg/mL的烏頭堿對照品溶液，經過0.45μm微孔濾膜處理，吸取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另配制空白凝膠和烏頭堿溫敏凝膠，取1mL并加入5mL pH 5.80的PBS，攪勻，經過0.45μm微孔濾膜處理，分別吸取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。通過比較得出：空白凝膠對烏頭堿的含量測定無干擾，見圖1。

2.5.4 精密度試驗 將烏頭堿對照品溶液（上述樣品a）平行進樣6次，得吸收峰面積標準偏差值RSD=0.76%（n=6）。表明該HPLC法具有很好重現性。

2.5.5 體外釋放度的測定 按最佳處方工藝制備烏頭堿溫敏凝膠，取1 g烏頭堿溫敏凝膠于試管中，在37℃恒溫搖床中放置10min，后加入5 mL pH 5.80的磷酸鹽緩沖溶液，溫度37℃，轉速 100 r/min，分別在 0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96 h取樣1mL，并補加1mL pH 5.80的磷酸鹽緩沖溶液，處理樣品進行高效液相色譜分析，繪出釋放曲線。

將釋放度Q與時間t分別用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程和Niebergull方程擬合，結果見表4。

由表4可知，擬合后以Higuchi方程的相關系數系數值（r=0.999 4）最大。以Q對t1/2作圖，結果表明，該樣品中烏頭堿遵循Higuchi方程，體外釋放顯示具有一定的緩釋作用。

3 討論

烏頭堿為難溶性藥物，且易水解，本實驗對其穩定性進行研究，選用pH 5.80的磷酸鹽緩沖液作為溶劑，且處方中加入甘油和1，2-丙二醇形成共溶劑能增加其溶解度，高分子溫敏材料P407亦能促進其溶解。

表4 釋藥模型擬合結果

單因素考察時P407的濃度大于16%形成凝膠，處方中P407的量為14.2%，這主要和烏頭堿溫敏凝膠的組成成分有關。甘油、1，2-丙二醇、透明質酸親水性強，與P407膠束爭奪水分子，導致P407疏水性增強，容易形成凝膠。

采用高效液相色譜法檢測，所用輔料對此檢測無干擾。體外釋放度表明，在37℃的磷酸鹽緩沖液（pH=5.80）的釋放介質中，樣品在96 h內的Q值可達89.45%。通過方程擬合，藥物從凝膠釋放到介質中的行為符合Higuchi釋放動力學模型。

本研究制備的烏頭堿溫敏凝膠是可供關節腔注射的，具備緩釋性能的新型藥物制劑，為烏頭堿治療類風濕性關節炎提供了一種新的給藥方式。

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The preparation and evaluation of aconitine thermosensitive hydrogel in vitro

GU Lingling LIJunli LIU Xiaoping WANGMeng ZHANG Zengwei
Pharmaceutical Engineering of Chemical Engineering,Wuhan University of Technology,Hubei Province,Wuhan 430070,China

Objective To prepare aconitine thermosensitive hydrogel and observe drug release in vitro.MethodsThe preparation of aconitine thermosensitive hydrogel was based on a carrier material poloxamer 407(P407).The optimum preparation process of aconitine thermosensitive hydrogelwas selected with orthogonal design.The release rate in vitro of it was determined in thermostatic shaker and the releasemedium was phosphate buffer(pH 5.80).ResultsThe gelling temperature of aconitine thermosensitive hydrogel was 36.3℃.The accumulative drug release of aconitine thermosensitive hydrogel in vitro reached 89.45%after 96 h.ConclusionThe aconitine thermosensitive hydrogelwith preferable release properties is prepared with a uncomplicated technology.It is valuablewith application prospect.

Aconitine;Poloxamer 407;Thermosensitive hydrogel

R943

A

1673-7210（2012）12（a）-0115-03

武漢理工大學自主創新研究基金擬資助項目（項目編號：Whut-2011-IV-023）；湖北省武漢市青年科技晨光計劃項目資助（項目編號：201271031391）。

顧玲玲（1989-），女，江西廣豐人，武漢理工大學2010級藥學專業在讀碩士研究生，主要從事藥物新劑型與新技術研究。

2012-09-03 本文編輯：衛 軻）