雞傳染性貧血病毒VP1基因的原核表達

馮 昕，榮 俊 (長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

匡紅艷 (長江大學臨床醫學院，湖北 荊州 434000)

雞傳染性貧血病毒VP1基因的原核表達

馮 昕，榮 俊 (長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

匡紅艷 (長江大學臨床醫學院，湖北 荊州 434000)

根據GenBank上公布的雞傳染性貧血病毒VP1的基因序列設計一系列引物,通過基因擴增得到了雞傳染性貧血病毒(CAV)VP1基因的全長片段和一系列不同N末端截斷的VP1基因片段，分別將這些片段插入表達質粒載體pET28a的多克隆位點上，構建成4種重組表達工程菌(E.coliBL21/pET-28-CAVVP1、E.coliBL21/pET-28-CAVVP1Nd29、E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56、E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd137)，研究了4種不同長度VP1片段在重組大腸桿菌中的表達， 并通過SDS-PAGE電泳篩選最佳表達方式。結果表明：E.coliBL21/pET-28-CAVVP1Nd29能表達分子質量為44ku的可溶性蛋白，E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56能表達分子質量為40ku的不可溶性蛋白，而在E.coliBL21/pET-28-CAV VP1 和E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd137的誘導表達產物中未見明顯的表達蛋白出現。其中可溶性的CAV VP1Nd29蛋白將有可能用于研制CAV診斷抗原和亞單位疫苗研究。

雞傳染性貧血；抗原蛋白；原核表達

雞傳染性貧血病毒(Chicken anemia virus，CAV)是雞傳染性貧血病(Chicken infectious anemia，CIA)的主要病原，主要侵害雛雞，造成以雞群死亡率升高、再生障礙性貧血、骨髓黃化、胸腺等淋巴器官萎縮為特征的免疫抑制性傳染病[1-2]。CAV 在雞群中廣泛存在,可水平傳播和垂直傳播。成雞感染 CAV 后呈亞臨床帶毒狀態,易被忽視,是養雞業上潛藏的巨大威脅。自1979年在日本首次分離到CAV[3]以來，包括我國在內的許多國家[4-5]都相繼證明了該病毒的存在。目前，CAV在世界范圍內已呈蔓延趨勢，成為危害家禽業的主要病原體之一，已引起世界各國禽業的廣泛關注。

CAV屬圓環病毒科環狀病毒屬，是已知的最小病毒之一，全基因組大小為2319bp，包括3個部分或完全重疊的開放閱讀框(ORF)，大小分別為1347、648 和363 個核苷酸殘基,其中648nt的ORF完全重疊,與1347nt 的ORF部分重疊[6]。3個ORF分別編碼52ku的衣殼蛋白VP1；24ku的分子伴侶VP2；14ku的細胞凋亡素VP3。VP1為CAV唯一的衣殼蛋白和主要免疫原蛋白，VP2為非結構蛋白，VP3為病毒的致病性蛋白，以凋亡的方式引起感染細胞的死亡[7]。Noteborn等[8]在昆蟲細胞中分別表達VP1、VP2或共表達VP1和VP2蛋白，發現單獨表達VP1或VP2均不能刺激雞產生CAV特異性抗體，而VP1和VP2共同表達產物則可誘導產生中和抗體。這表明被表達的重組VP1、VP2蛋白可以被用作一種亞單位疫苗。

為研究適用于亞單位疫苗用的CAV 原核表達抗原蛋白，本研究對CAV VP1的N端基因序列進行不同程度的剪切，并與pET-28a載體連接，構建成VP1基因的不同表達載體，實現不同長度CAV VP1片段的的表達，并比較不同VP1基因片段表達產物的差異，篩選出合適的蛋白表達方式，為VP1病毒的檢測用抗原蛋白和亞單位疫苗的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 CAV毒株與菌株

CAV毒株由中國獸醫藥品監察所提供，大腸桿菌DH5α、BL21購自全式金生物技術有限公司，pMD-18T載體購自大連寶生物公司,EcoRⅠ、XhoⅠ購自大連寶生物公司。

1.2 引物設計

根據Hiremath等在GenBank公布的VP1序列設計引物。引物序列詳見表1。其中5’-端有下劃線的部分是附加的酶切位點，上游引物為EcoRⅠ，下游引物為XhoⅠ。所有引物由三博遠志生物技術公司合成。

表1 CAV VP1基因N端剪切系列引物序列

1.3 VP1基因的PCR擴增

以CAV種毒培養液為模板，使用上述引物擴增VP1全序列以及VP1Nd29、 VP1Nd56、VP1Nd137片段。反應體系為毎管10倍PCR buffer 2μl，dNTP 0.2μl，上下游引物各1μl，模板2μl，Taq酶0.2μl，用ddH2O補體積至20μl。熱循環參數為：94℃ 5min；94℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 1min30s，35個循環；72℃ 10min，4℃ 2min終止。取PCR產物10μl瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.4 擴增產物的克隆載體構建

將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外燈下切下目的條帶，用DNA片段凝膠回收試劑盒純化目的片段。純化后的目的片段同pMD18-T載體連接，連接體系：5倍連接酶buffer 2μl，PCR回收產物6.5μl，pMD-18T載體0.5μl，連接酶1μl，16℃連接過夜。用連接產物轉化DH5α大腸桿菌，涂布于加有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養過夜。挑取單個菌落接入含氨芐青霉素的液體LB培養基中震蕩培養，取菌液以上述體系進行PCR擴增鑒定，選取結果為陽性轉化菌的提取質粒，分別命名為：pMD-CAV VP1、pMD-CAV VP1Nd29、pMD-CAV VP1Nd56和pMD-CAV VP1Nd137。

1.5 表達載體的構建

將回收質粒的pMD-CAV VP1、pMD-CAV VP1Nd29、pMD-CAV VP1Nd56和pMD-CAV VP1Nd137，連同表達質粒載體pET-28a分別用EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切。目的片段用瓊脂糖凝膠電泳回收，使用T4連接酶連接目的片段與線性化的質粒載體pET-28a，用連接產物轉化DH5α大腸桿菌，涂布于含卡那霉素的LB平板上培養。挑取單個菌落按1.3所述方法進行PCR擴增鑒定，陽性的即為重組表達質粒。分別命名為：pET-28-CAV VP1、pET-28-CAV VP1Nd29、pET-28-CAV VP1Nd56和pET-28-CAV VP1Nd137。

1.6 目的基因的表達

將上述重組質粒分別轉化大腸桿菌BL21感受態細胞。其轉化菌分別命名為：E.coliBL21/pET-28-CAV VP1，E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29、E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56和E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd137。分別挑取單菌落接入含卡那霉素的LB培養基中，37℃培養過夜。按1∶100接菌到含卡那霉素的30ml的LB培養基中，37℃培養至光密度值達到0.6時，加入濃度為0.2mol/L的乳糖3ml，分別在25℃誘導表達過夜[9]，和37℃中誘導5h后收集菌體，用0.02mol/L pH7.4的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液懸浮菌體并用超聲波破碎，分別收集破碎后的上清液和沉淀。

1.7 表達蛋白的分析

將收集到的上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳，檢測重組表達蛋白的情況并比較全序列與幾種不同剪切方式表達蛋白可溶性的差異。

2 結果與分析

2.1 CAV VP1基因片段的擴增

M:DNA Marker;1：空白對照；2：CAV VP1全基因；3：CAV VP1Nd137;4：CAV VP1Nd56；5：CAV VP1Nd29;6：CAV VP1全基因

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，發現在1350、1263、 1182、939bp處有DNA擴增帶(圖1)，大小與預期相同。

M：蛋白質分子質量標準；1：空白表達菌全菌對照；2：E.coli BL21/pET-28-CAV VP1全菌；3：E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd29全菌；4：E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56全菌；5～6：E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137全菌；7：E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd29上清

2.2 VP1重組表達質粒的鑒定

對重組表達質粒pET-28-CAV VP1、pET-28-CAV VP1Nd29、pET-28-CAV VP1Nd56和pET-28-CAV VP1Nd137進行PCR擴增鑒定，結果與圖1一致，表明目的片段已經成功克隆到了表達載體上。

2.3 重組表達載體的誘導表達

將含有各組表達載體的陽性菌經乳糖誘導表達，經SDS-PAGE電泳分析發現E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29、E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56經誘導后有明顯表達帶出現，前者分子質量在44ku附近，后者分子質量在40ku附近。而E.coliBL21/pET-28-CAV VP1和E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd137無明顯表達(圖2)。

2.4 表達蛋白的溶解特性

將表達菌超聲波裂解后，分別取上清液和沉淀進行電泳，發現E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29表達片段在上清液中非常明顯，E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56重組蛋白絕大部分以沉淀形式存在，上清中含量很少(圖3、圖4)。

3 討論

本研究嘗試將VP1片段以正確的方式插入pET-28a載體中，構建的表達菌E.coliBL21/pET-28-CAV VP1未能獲得明顯的表達。而將VP1片段進行不同方式的裁剪后構建的E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29和E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56經誘導后有明顯表達帶出現，E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd137無明顯表達。在2個能有明顯表達的工程菌中E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29的表達產物至少有半數是可溶的蛋白質，而E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd56的表達產物幾乎全不可溶。

目前國內尚無標準的CAV ELISA診斷試劑盒，給CAV引起的疾病的調查和診斷帶來諸多不便。與全毒抗原相比，原核表達的重組蛋白作為抗原可以克服CAV在體外培養效率低，難以獲得大量診斷用抗原的缺點，而且重組抗原成分相對單一，免疫反應的特異性會更強。另一方面,目前對于CAV的防治尚無理想的疫苗，國內外研制出的活疫苗和滅活疫苗雖已用于免疫接種，但均存在病毒體外培養困難和價格高昂的缺陷[10]。目前尚未分離到非致病性的毒株，因此所用的活疫苗株都為弱致病性的毒株，免疫后持續感染，蛋源傳播和毒力增強的風險都很大。本研究探討了利用原核表達系統表達CAV抗原蛋白的方法，以E.coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29表達菌最優，實現了體外大量表達，且有相當部分可溶。這為進一步研究CAV的致病機制和研制CAV重組診斷抗原、亞單位疫苗奠定了基礎。

M: 蛋白質分子質量標準;1:空白表達菌上清對照;2:E. coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd29 表達上清; 3:E. coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56 表達上清; 4 ～ 5: E. coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd137 表達上清; 6: E.coli BL21/pET-28-CAV VP1 表達上清

M: 蛋白質分子質量標準; 1: 空白表達菌沉淀對照; 2:E. coliBL21/pET-28-CAV VP1Nd29 表達沉淀部分; 3:E. coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56 表達沉淀部分; 4 ～5:E. coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd137 表達沉淀部分; 6: E. coli BL21/pET-28-CAV VP1 表達沉淀部分

[1]Bounous D I,Goodwin M A,Brooks R L,et al.Immunosuppression and intracellular calcium signaling in splenocytes from chicks infected with chicken anemia virus,CL21 isolate[J].Avian Dis,1995,39:135-140.

[2]Dehead T P,Van Den Bosch G,Ducatell E R,et al. Epidemiology and significance of chicken infectious anemia virus infections in broilers and broiler parents under nonvaccinated European circumstances[J].Avian Dis,2001,45 :706-708.

[3]Yuasa N T,Taniguchi,Yoshida I.Isolation and some characteristics of agent inducing anemia in chicks[J].Avian Dis,1979,23:366-385.

[4]金文杰,崔治中,劉岳龍,等.傳染性法式囊病料中 MDV、CAV、REV 的共感染檢測[J].中國獸醫學報,2001,21(1):6-8.

[5]段玉友,肖雪君,潘志明,等.用 digoxi-genin 標記 DNA 探針檢測雞貧血病病毒感染[J].中國畜禽傳染病,1997,(1):16-17.

[6]鄢明華，劉長軍，王英珍，李秀麗.雞傳染性貧血病毒分子生物學研究進展[J].天津農業科學,2002,8(3):48-50.

[7]王 娟,張維軍,劉桂林.雞傳染性貧血病毒分子生物學研究進展[J].獸醫研究,2006，(2),12:8-11.

[8]Noteborn M H,Verchueren C A,Koch G,et al.Simultaneous expression of recombinant baculovirus-encoded chicken anemia virus(CIAV) proteins VP1 and VP2 is required for formation of the CIAV-specific neutralizing epitope [J]. J Gen Virol,1998,79:3073-3077.

[9]Marshak D R,Kadonaga J T,ButgessR R,等(朱厚礎譯).蛋白質純化與鑒定實驗指南[M].北京:科學出版社,1999:148-156.

[10]Daniel T.Circoviruses immunosuppressive threats to avian species are view [J].Avian Pathol,2002,29:374-394.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.03.010

Q786

A

1673-1409(2012)03-S034-04

2012-03-10

馮 昕(1987-)，男，湖北荊州人，碩士生，現從事基因工程疫苗研究。

榮 俊，E-mailrongjun59626@gmail.com。