四種檢測法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的比較

胡洪華 蔣 婷 宋海星 胡瀚丹

1.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川成都 610083；2.成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，四川成都 610083

四種檢測法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的比較

胡洪華1蔣 婷1宋海星2▲胡瀚丹1

1.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川成都 610083；2.成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，四川成都 610083

目的比較四種方法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的檢測效果，建立一種能快速檢測去蛋白率的方法。 方法用乙腈沉淀法去除血清蛋白，分別應(yīng)用四種不同的檢測分析方法，方法Ⅰ通過真空凍干；方法Ⅱ通過真空干燥；方法Ⅲ通過設(shè)立對照調(diào)零；方法Ⅳ通過揮干乙腈，分析血清蛋白的去除率。 結(jié)果 方法Ⅰ和方法Ⅱ耗時長、設(shè)備要求高；方法Ⅲ耗時最短、方法簡便；方法Ⅳ耗時較短、但容易產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)誤差，方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的蛋白去除率結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與方法Ⅳ比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 方法Ⅲ為最佳的分析測定分析方法，可用于快速方便了解乙腈的去蛋白率。

乙腈沉淀法；血清蛋白；去蛋白率

研究表明血清中有20多種高豐度蛋白質(zhì)，占血清總蛋白的80%以上，而對疾病診斷有密切關(guān)系的蛋白含量甚微[1]。在檢測過程中血清高豐度蛋白質(zhì)不僅會掩蓋許多重要低豐度蛋白質(zhì)，還會相對減小低豐度蛋白質(zhì)的上樣量，使得低豐度蛋白質(zhì)的難分離純化[2]。在進(jìn)行蛋白組研究中，對血清樣本進(jìn)行預(yù)處理，去除血清中的高分子量、高豐度蛋白質(zhì)，排除它們對低豐度蛋白質(zhì)的掩蓋作用，促進(jìn)低豐度蛋白質(zhì)的檢出很有必要。目前常用的去蛋白技術(shù)有蛋白質(zhì)沉淀法、親和技術(shù)、色譜技術(shù)等[3]。蛋白質(zhì)沉淀法是一種快速蛋白質(zhì)去除方法，乙腈沉淀法能去除血清中高豐度蛋白,是一種簡便、經(jīng)濟(jì)、有效的前期處理方法[4]。快速檢測出乙腈的去蛋白率在研究中顯得十分必要，本研究旨在探索一種新的快速的檢測方法檢測其去蛋白率。

1 材料與方法

1.1 材料

血清標(biāo)本來源于GIBCO公司生產(chǎn)的小牛血清；乙腈（ACN）為美國sigma公司生產(chǎn)；吸光度檢測儀為ND-1000分光光度計(jì)；Block Heaters GL-50為海門市其林貝爾儀器有限公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品；真空冷凍凍干系統(tǒng)為美國Themo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

從-80℃取出血清于4℃條件下解凍，解凍后，用超純水稀釋成5倍和25倍共3個待測血清樣本。每個樣品進(jìn)行4次平行試驗(yàn)，每個待測濃度按四種分析方法進(jìn)行分析檢測，分別計(jì)算每種分析方法的去蛋白率。見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間分析比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，去蛋白率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察結(jié)果

去除蛋白后的上清液較去除蛋白前比較顏色明顯變淡，干燥后的樣本有黃色固體物附著于管壁，用超純水溶解于1.5 mL的EP管中，溶液澄清透明，如水樣。其顏色深淺與蛋白濃度成正相關(guān)。

2.2 四種方法提取成功結(jié)果及耗時比較分析

四種方法對三種不同濃度的樣本進(jìn)行去蛋白的處理，每個樣本進(jìn)行四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，分別檢測其去蛋白率。分析四種方法的實(shí)驗(yàn)成功率和耗時，四種方法的成功率均為100%，四種方法的耗時差異明顯，方法Ⅲ通過建立實(shí)驗(yàn)對照組，通過調(diào)零，方便、快捷、耗時短（表 2）。

表1 檢測方法

表2 四種方法提取的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 紫外分光光度法檢測蛋白濃度

四種方法對三種不同濃度的樣本進(jìn)行去蛋白處理，通過紫外分光光度法檢測樣品去蛋白前后的蛋白濃度，并通過4次復(fù)實(shí)驗(yàn)分析去蛋白前后的蛋白濃度（表3）。

表3 紫外分光光度法檢測分析個樣本的蛋白濃度（±s，ng/μL）

表3 紫外分光光度法檢測分析個樣本的蛋白濃度（±s，ng/μL）

編號 樣品濃度 去蛋白前蛋白濃度 去蛋白后蛋白濃度方法Ⅰ方法Ⅱ方法Ⅲ方法Ⅳ高中低高中低高中低高中低45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 0.97±0.04 0.28±0.05 0.13±0.03 0.91±0.07 0.30±0.02 0.18±0.09 0.37±0.07 0.17±0.11 0.01±0.01 3.36±0.06 1.38±0.07 0.52±0.06

2.4 去蛋白率的分析

方法Ⅰ、Ⅱ和方法Ⅳ相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與方法Ⅲ比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.5 標(biāo)本蛋白濃度對去蛋白率影響的分析

標(biāo)本蛋白濃度對去蛋白率的影響應(yīng)用標(biāo)本蛋白濃度的單因素方差分析表明，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。可見標(biāo)本蛋白濃度因素對去蛋白率無影響。

3 討論

質(zhì)譜鑒定蛋白技術(shù)已經(jīng)比較成熟，樣品有一定的純度和濃度是得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果的前提條件，而高豐度蛋白的存在必然嚴(yán)重干擾小分子蛋白質(zhì)的分離檢測和鑒定[5]。理想的蛋白質(zhì)去除技術(shù)應(yīng)該是具有選擇性的,即能100%地去除不需要研究的高豐度蛋白質(zhì)，同時又對擬研究的小分子蛋白質(zhì)的含量或活性不產(chǎn)生影響[6-7]。乙腈去蛋白質(zhì)法是一種快速的去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)的方法，在研究中即時知道乙腈的去蛋白效果是每位研究者急切關(guān)注的問題。

綜合以上四種檢測乙腈去除高豐度蛋白質(zhì)的方法，可以看出方法Ⅰ是種參考方法，通過低溫凍干的方式將含低豐度蛋白質(zhì)的溶液凍干，再用超純水復(fù)溶檢測計(jì)算乙腈的去蛋白率。方法Ⅱ是一種常用方法，但其耗時較長。方法Ⅳ通過揮干的方式去掉溶劑，在實(shí)驗(yàn)過程中對設(shè)備的要求較高且容易產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)誤差。本研究提示方法Ⅳ與其他方法相比，蛋白檢測率差異明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過比較，結(jié)果提示在實(shí)驗(yàn)中通過建立對照組，在紫外法檢測蛋白濃度時使用對照調(diào)零去除乙腈對的干擾，可快速檢測出乙腈的去蛋白效果。

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Comparison of four method for removing serum protein by acetonitrile precipitation

HU Honghua1JIANG Ting1SONG Haixing2▲HU Handan1
1.School of Laboratory Medicine,Chengdu Medical College,Sichuan Province,Chengdu 610083,China;2.Department of Biomedical Sciences,Chengdu Medical College,Sichuan Province,Chengdu 610083,China

Objective To compare the test effect of serum protein removal rate by acetonitrile precipitation with four different methods,the aim is to establish a rapid test method to detect the serum protein removal rate.Methods The serum proteins were removed by acetonitrile precipitation experiments,and applied for four different detection methods,vacuum freeze-drying(methodⅠ),vacuum drying(methodⅡ),controlled through the establishment of zero(method Ⅲ),dryness acetonitrile(methodⅣ)were detected the serum protein removal rate in respect.Results MethodⅠand methodⅡwere time-consuming and higher equipment requirements,while methodⅢwas time-saving and simple,although methodⅣwas time-saving,it was prone to experimental error,methodⅠ,Ⅱ andⅢ proteins removal results revealed no significant difference (P>0.05)compared with methodⅣ,which had statistically significant difference (P<0.05).Conclusion MethodⅢis the best analysis of measurement and analysis method,and can be used to understand the removal quickly and easily.

Acetonitrile precipitation;Serum proteins;Protein removal rate

R446.1

A

1673-7210（2012）08（b）-0085-02

成都醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（CX2010013）。▲

2012-03-28 本文編輯：谷俊英）