紫外-可見分光光度法測定普樂安片中總甾醇含量

盛衛(wèi)國 葉劍鋒 徐 勇 吳 健 馬麗萍 王如偉

浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究院有限公司浙江省中藥制藥技術重點實驗室，浙江杭州 310052

紫外-可見分光光度法測定普樂安片中總甾醇含量

盛衛(wèi)國 葉劍鋒 徐 勇 吳 健 馬麗萍 王如偉

浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究院有限公司浙江省中藥制藥技術重點實驗室，浙江杭州 310052

目的 建立紫外-可見分光光度法測定普樂安片中總甾醇的含量測定方法。 方法 以β-谷甾醇為對照品，通過香草醛-高氯酸顯色反應，測定普樂安片中總甾醇的含量。 結果 對照品和樣品最大吸收波長均在542 nm，對照品β-谷甾醇在0.030 39～0.081 04 mg范圍內(nèi)線性關系良好，r=0.998 8，樣品平均回收率為100.6%，RSD=2.75%。結論 本法測定總甾醇含量準確、靈敏，重現(xiàn)性好，可用于測定普樂安片中總甾醇含量，為普樂安片質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

紫外-可見分光光度法；β-谷甾醇；普樂安片；總甾醇；含量測定

普樂安片是以油菜蜂花粉為原料制成的片劑，具有補腎固本的功能，主治腎氣虧虛所致的腰膝酸軟，尿后余瀝或不禁，臨床用于前列腺增生和慢性前列腺炎的治療，療效確切，安全性高。目前研究結果顯示[1-5]，植物甾醇可以很大程度地改善良性前列腺增生（BPH）患者泌尿系統(tǒng)癥狀，對抑制前列腺肥大和改善膀胱收縮均有明顯效果。油菜花粉中總甾醇含量測定尚未見報道，本法通過紫外-可見分光光度法測定普樂安片中總甾醇含量，為提升普樂安片質(zhì)量標準提供可靠依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2201紫外可見分光光度計（日本島津公司）；AX205分析天平（METTLER TOLEDO公司）；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）。

1.2 試藥

普樂安片（浙江康恩貝制藥股份有限公司）；β-谷甾醇對照品（上海中藥標準化研究中心，供含量測定用，批號：16-2001），高氯酸、香草醛、冰醋酸、氯仿等試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取β-谷甾醇對照品10.13 mg于10 mL量瓶中，加三氯甲烷適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密移取1.0 mL于10 mL量瓶中，用三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得，濃度為0.101 3 mg/mL。

2.2 供試品溶液的制備

取普樂安片若干，用潤濕的潔凈紗布小心擦去表面薄膜衣層，70℃減壓干燥2 h，置研缽中研磨成粉，過80目篩，稱取本品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL氯仿，密塞稱定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，用氯仿補足失重，搖勻，濾過。精密移取續(xù)濾液10 mL于燒瓶中，減壓蒸干，加入20 mL 10%氫氧化鈉-乙醇溶液，95℃水浴回流2 h，放冷，加入40 mL蒸餾水，振搖，混勻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取3次，每次20 mL，合并正己烷萃取液，用蒸餾水洗滌正己烷液2次，每次40 mL，棄去水層，正己烷層減壓回收至適當體積后，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用適量正己烷洗滌燒瓶，洗滌液并入量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 測定條件的選擇

2.3.1 測定波長的選擇

精密移取0.5 mL β-谷甾醇對照品溶液、1.0 mL供試品溶液于10 mL具塞玻璃管中，85℃水浴揮盡溶劑，加入0.6 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混勻，密塞，70℃水浴保溫30 min，取出，流水迅速冷卻至室溫，精密加入冰醋酸4.6 mL，搖勻，隨行試劑作空白，在190～900 nm進行波長掃描，對照品和供試品溶液均在在542 nm有最大吸收峰，故選擇542 nm為總甾醇含量測定的檢測波長。

2.3.2 顯色條件的選擇

2.3.2.1 顯色反應正交設計 采用四因素三水平L9（34）正交試驗優(yōu)選顯色條件，正交因素水平表設計見表1。

表1 顯色條件正交設計因素水平表

精密移取0.5 mL β-谷甾醇對照品溶液于10 mL具塞玻璃試管中，85℃水浴揮盡溶劑，加入不同用量5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混勻，密塞，70℃水浴保溫30 min，取出，流水迅速冷卻至室溫，精密加入不同用量冰醋酸，使溶液體積為6.0 mL，搖勻，隨行試劑作空白，在542 nm處測定吸光度值，結果見表2。

表2 顯色反應正交設計試驗結果

表3 方差分析

由表2可見，直觀分析顯示各因素對顯色反應吸光度的作用主次為A>C>B，最佳顯色條件為A3B3C3；方差分析結果表明A因素有統(tǒng)計學意義，而B、C因素無統(tǒng)計學意義；由于顯色溫度對吸光度無顯著影響，考慮供試品穩(wěn)定性，顯色溫度70℃為佳。

2.3.2.2 高氯酸用量的選擇 參考文獻報道，高氯酸用量對顯色反應有較大影響，故在已選定的顯色條件下，以β-谷甾醇對照品制備供試品溶液，單獨考察不同高氯酸用量對顯色反應的影響。結果顯示，隨著高氯酸用量增加，吸光度增加，當用量為1.2 mL時，吸光度出現(xiàn)下降；用量為0.4 mL時，λmax為545 nm，用量為1.0 mL時，λmax為541 nm，可見不同高氯酸用量可引起最大吸收波長及吸光度的變化，考慮對照品和供試品最大吸收波長的一致性以及供試品的穩(wěn)定性，高氯酸用量以0.8 mL為宜。

綜上所述，總甾醇最佳顯色條件為：精密移取適量對照品溶液、供試品溶液于10 mL具塞玻璃試管中，85℃水浴揮盡溶劑，加入0.6 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混勻，密塞，70℃水浴保溫30 min，取出，流水迅速冷卻至室溫，精密加入冰醋酸4.6 mL，搖勻，隨行試劑作空白，于542 nm測定吸光度。

2.3.2.3 顯色穩(wěn)定性試驗 精密移取0.5 mL β-谷甾醇對照品溶液、1.0 mL供試品溶液于10 mL具塞玻璃試管中，自“85℃水浴揮盡溶劑”起，按確定的顯色條件進行顯色，分別于顯色結束 10、15、20、25、30 min 測定對照品和供試品吸光度變化，結果表明對照品和供試品在30 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。

2.4 總甾醇標準曲線的制備

精密移取0.101 3 mg/mL的β-谷甾醇對照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 于 10 mL 具塞玻璃試管中， 自“85℃水浴揮盡溶劑”起，按確定的顯色條件進行顯色和測定，以對照品質(zhì)量和吸收值進行回歸計算，得回歸方程Y=-0.062 08+11.033 7 X，r=0.998 8，表明 β-谷甾醇在 0.030 39～0.081 04 mg線性關系良好。

2.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗

按供試品溶液的制備方法，自“稱取本品0.5 g”起制備供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、6、8 h 各精密移取 1.0 mL 于10 mL具塞玻璃試管中，自“85℃水浴揮盡溶劑”起，按確定的顯色條件進行顯色和測定，測得不同時間供試品溶液中β-谷甾醇含量見表4，RSD=2.33%，說明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 供試品溶液穩(wěn)定性試驗

2.6 精密度試驗

2.6.1 重復性

取普樂安片適量（批號：090220），按上述含量測定方法制備6份供試品溶液，測得總甾醇的含量分別為2.70%、2.66%、2.64%、2.79%、2.61%、2.70%，平均含量為 2.68%，RSD=2.36%，表明其重復性良好。

2.6.2 中間精密度

取普樂安片適量（批號：090220），按上述含量測定方法，于數(shù)天內(nèi)測定總甾醇含量，分別為2.64%、2.68%、2.71%、2.71%、2.57%、2.55%，平均含量 2.64%，RSD=2.64%，中間精密度良好。

2.7 加樣回收率試驗

取普樂安片適量（批號：090220），按供試品溶液的制備方法，稱取6份，每份0.25 g，精密稱定，精密加入β-谷甾醇對照品溶液（含β-谷甾醇6.626 mg），自“精密加入50 mL氯仿”起，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按確定的顯色條件進行顯色和測定，計算加樣回收率，結果見表5，表明本法回收率符合要求。

2.8 普樂安片中總甾醇含量測定

取5批不同批號的普樂安片，按上述含量測定方法測定總甾醇含量，結果分別為2.44%、2.43%、2.49%、2.46%、2.48%。

表5 總甾醇加樣回收試驗結果

3 討論

3.1 樣品溶液的皂化處理

樣品溶液如果不進行皂化處理直接按顯色條件進行顯色，其最大吸收峰在537 nm，與對照品最大吸收峰542 nm相差較大，不符合《中國藥典》2005年版附錄ⅤA[6]紫外-可見分光光度法對供試品溶液吸收峰波長的規(guī)定。樣品經(jīng)皂化處理后，吸收峰波長與對照品最大吸收峰波長一致，符合規(guī)定，故樣品需進行皂化處理。

3.2 顯色方法的選擇

根據(jù)文獻報道，選擇了Liebermann反應、改良Liebermann-Burchard試劑進行顯色反應，但樣品、對照品均存在吸光度變化快，無明顯的顯色穩(wěn)定時間，故不適合作為本樣品甾醇顯色方法，香草醛-高氯酸反應靈敏度高，顯色穩(wěn)定，適合作為甾醇含量測定的顯色反應。

[1]Coleman CI，Hebert JH，Reddy P，et al．The efect of phytosterols on quality of life in the treatment of benign prostatic hyperplasia[J]．Pharmacother，2002，22（11）：1426-1432．

[2]程麗艷，鄭曉亮，屠凌嵐，等，植物甾醇對非細菌性前列腺炎治療作用的實驗研究[J].中國臨床藥理學與治療學，2010，9（15）：991-996.

[3]趙國志，劉喜亮，劉智鋒.植物甾醇及其產(chǎn)品開發(fā)利用（下）[J].糧食與油脂，2006，（3）：3-8.

[4]徐卓云.植物類制劑治療良性前列腺增生的作用研究進展[J].中國現(xiàn)代實用醫(yī)學雜志，2006，5（5）：41-43．

[5]韓軍花.植物甾醇的性質(zhì)、功能及應用[J].國外醫(yī)學：衛(wèi)生學分冊，2001，28（5）：285-287．

[6]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部．北京：化學工業(yè)出版社，2005：附錄28.

Quantitative determination of total sterol in Pule'an Tablets by UV spectrophotometry

SHENG WeiguoYE JianfengXU YongWU Jian MA LipingWANG Ruwei
Zhejiang Modern Chinese Medicine and Natural Drug Research Academy Co.,LTD.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacecutical Technology,Zhejiang Province,Hangzhou 310052,China

Objective To establish the determination method of total sterol in Pule'an Tablets by UV spectrophotometry.Methods The determination was performed by using β-sitosterol as control substance.Through the vanillin-high chlorine acid color reaction,the content of total sterols in Pule'an Tablets were determined.Results The absorption wavelength of reference substance and sample maximum were both in the 542 nm.The absorbency and quality of β-sitosterol have good linearity in the range of 0.030 39-0.081 04 mg (r=0.998 8).The average recovery rate was 100.6%with RSD=2.75%.Conclusion The method is simple,highly accurate,reproducible,and can be applied to the determination of total sterol in Pule'an Tablets.

UV Spectrophotometry;β-sitosterol;Pule'an Tablets;Total sterol;Content determination

R285.5

A

1673-7210（2012）08（b）-0008-03

浙江省科技計劃項目（項目編號：2009E10009）；杭州市科技發(fā)展計劃項目（項目編號：20061921N01）。

盛衛(wèi)國（1972-），男，博士，工程師；研究方向：藥物制劑新劑型與新技術。

王如偉，高級工程師，博士生導師。

2012-02-16 本文編輯：衛(wèi) 軻）