絨毛組織冷凍切片與靶向超聲微泡造影劑的結合特性研究

廖玲敏 潘銳柯 周力學薛淑娟 張莘 周楠 狄娜

中山大學孫逸仙紀念醫院婦產科，廣東 廣州 510120

近年來隨著超聲造影劑制備技術的不斷改進，靶向超聲微泡造影劑（targeted microbubble contrast agents, TMCA）在疾病診斷和治療中的作用成為一個研究熱點。經靜脈注入帶有特定配體的靶向微泡造影劑，在體內通過配體與受體結合的方式，使微泡選擇性聚集并較長時間停留于靶組織或靶器官而達到靶向顯影[1]。目前國內外已有多篇關于TMCA應用于各種腫瘤早期診斷的報道[2-3]。有研究證實，在體外靶向微泡與絨毛膜癌細胞可特異性結合，流其結合力具有一定的強度，有望能抵抗毛細血管內血流生理性沖洗的破壞，實現靶向顯影[4-6]。本研究旨在探討耦合抗人絨毛膜促性腺素（anti-human chorionic gonadotropin beta，β-HCG）抗體TMCA的穩定性及靶向微泡與妊娠絨毛組織在體外的結合特性，為今后滋養細胞腫瘤的早期診斷、準確定位及評估化療療效提供更為準確和科學的依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

實驗組選自中山大學孫逸仙紀念醫院婦產科2010年3月—2011年2月進行門診人工流產術患者的妊娠絨毛組織。患者年齡20～36歲，妊娠時間均在6～7周，平時月經規律，無內分泌紊亂、自然流產、習慣性流產、稽留流產史等。

對照組選同期本科室收治的宮頸癌行全子宮切除術患者的內膜組織，患者年齡均＜40歲，月經規律，有生育史，臨床和病理排除子宮內膜癌、子宮內膜增生癥、子宮內膜息肉、子宮黏膜下肌瘤等。

本實驗得到本院生殖醫學倫理委員會的批準，并獲得患者知情同意。

1.2 材料和儀器

聲諾維（SonoVue）由瑞士BRACCO Imaging BV公司生產；鼠抗β-HCG、熒光素標記兔抗小鼠IgG（rabbit anti-mouse IgG/FITC）和兔抗鼠IgG血清，購于北京博奧森生物技術有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC），購于美國SIGMA公司；倒置熒光顯微鏡；FACS Calibur流式細胞儀。

聲諾維混懸液：凍干粉[聚乙二醇4000、二硬脂磷酰脂膽堿（DSPC）、二棕櫚磷酰脂甘油（DPPGNA）、棕櫚酸]25 mg和SF6氣體59 mg緩慢加入到0.9%NaCl溶液5 mL，靜置備用。使用期間應密封，避免氣體彌散。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集、保存及處理取人流室做負壓吸引術獲取的新鮮妊娠絨毛組織和在開腹或經陰式全子宮切除術獲取的子宮內膜組織，立即由本院病理科做快速冷凍切片。取1張用蘇木素-伊紅染色，由病理科醫生閱片證實為正常妊娠絨毛組織。切片后立即保存于-29℃冰箱中，當日使用完畢。

1.3.2 靶向微泡造影劑的制備與鑒定 TMCA的制備按參考文獻方法進行[4,7]。玻片凝集試驗：取4張潔凈載玻片A、B、C、D，其中A、B載玻片分別加20 μL靶向微泡造影劑，C、D載玻片上加20 μL 聲諾維。然后，A、C載玻片上分別滴加等容積兔抗鼠IgG血清，B、D載玻片上分別滴加等容積的0.9%NaCl溶液。不時搖動，光鏡下觀察。免疫熒光實驗：取制備好的TMCA和聲諾維混懸液各50 μL，分別加入等容積FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體稀釋液，避光反應15 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 靶向微泡造影劑穩定性的檢測取FITC標記兔抗鼠IgG抗體稀釋液100 μL，用0.01 mol/L pH 7.4 PBS以1∶20稀釋；稀釋后加入上述制備好的TMCA 2 mL混合后，振蕩混勻，避光反應10 min，用PBS洗滌混懸液，去除游離抗體。用500μL TMCA＋500 μL PBS作為空白對照組。在流式細胞儀上進行檢測，分別檢測1、10 、20 及30 min各時間點聲諾維混懸液和抗β-HCG抗體的結合率，觀察普通微泡與抗體結合率隨時間變化的情況。重復檢測17個樣本。

1.3.4 靶向微泡造影劑與絨毛組織切片的尋靶實驗將妊娠絨毛組織冷凍切片隨機分為TMCA組（A組）和聲諾維組（B組），每組各10張切片，分別與TMCA、聲諾維混懸液進行結合實驗；將正常子宮內膜組織冷凍切片隨機分為TMCA(C組）和聲諾維組（D組），每組各10張切片，分別與TMCA、聲諾維懸混液進行結合反應。在顯微鏡下觀察微泡與絨毛組織結合情況，以每個絨毛組織上結合20個以上微泡為陽性，每張切片隨機觀察6個不同的絨毛組織，以子宮內膜組織為對照組。

觀察5 min后，用新配制的PBS反復沖洗絨毛組織切片上的TMCA，然后在顯微鏡下觀察TMCA微泡與絨毛組織結合情況，比較沖洗前后TMCA微泡與絨毛組織結合率來評價結合的穩定性。

抗體阻斷實驗的過程：取絨毛組織冷凍切片，復溫20 min，PBS沖洗3次后；在切片上滴加100 μL 鼠抗β-HCG稀釋液，37℃溫育5 min，用PBS沖洗去除未結合的游離抗體；再加入TMCA 100 μL，37 ℃溫育5 min；用PBS洗滌后，計數絨毛組織與TMCA的結合情況；以子宮內膜組織為對照。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 靶向微泡造影劑的鑒定結果

本實驗中制備的TMCA為乳白色混懸液，光鏡下觀察，微泡大小、分布均勻，與普通聲諾維微泡無異。當加入兔抗鼠IgG抗血清后，光鏡下觀察原來均勻分布的TMCA形成輕度凝集狀態，微泡之間連成串狀形如葡萄。而加0.9%NaCl溶液后仍是均勻分散的微氣泡。聲諾維加入兔抗鼠抗血清或0.9%NaCl溶液后均未見凝集反應。經FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體稀釋液染色后，熒光顯微鏡下觀察可見TMCA殼表面發出環狀明亮的的綠色熒光，而單純的聲諾維微泡表面則未見熒光。

2.2 流式細胞儀檢測結果

聲諾維微泡與鼠抗β-H C G的結合率在1 、10 、20 及30 min分別為（92.25±2.18）%、（93.59±4.46）%、（95.27±2.88）%、（95.80±1.50）%，其結合率隨時間的增加越來越高。其中1 min時的結合率分別與20、30 min的結合率相比，差異有統計學意義（P＜0.05），10 和30 min的結合率差異有統計學意義（P＜0.05），而其他幾個時間點的差異無統計學意義（圖1）。

2.3 靶向微泡造影劑與絨毛組織切片的尋靶實驗結果

圖1 抗體與微泡結合率A：1 min；B：10 min；C：20 min；D：30 min

圖2 聲諾維與絨毛組織、子宮內膜組織結合率（×200）A：TMCA與絨毛組織結合；B：SonoVue與絨毛組織結合；C：聲諾維與子宮內膜組織結合；D：聲諾維與子宮內膜組織結合

TMCA與妊娠絨毛組織溫育5 min后，在光鏡下觀察可見大量TMCA聚集在絨毛滋養層細胞周圍（圖2A），僅少量的聲諾維微泡散在結合于絨毛組織切片上（圖2B）；而對照組子宮內膜組織僅少量的TMCA或聲諾維微泡散在結合于組織間隙（圖2C、D）。TMCA與絨毛組織和子宮內膜組織結合的陽性率分別為（83.30±2.15）%（13.30±2.58）%，兩組相比差異有顯著的統計學意義（P＜0.01）；聲諾維與絨毛組織和子宮內膜組織結合率分別為（15.00±3.07）%和（8.30±1.48）%，兩組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；TMCA與絨毛組織結合率和聲諾維與絨毛組織結合率相比，其差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；T M C A和子宮內膜組織結合率與聲諾維和內膜組織結合率相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

TMCA與絨毛組織沖洗前后的結合率：TMCA與絨毛組織反應5 min后，顯微鏡下觀察到微泡大部分聚集在絨毛滋養層細胞周圍，而組織切片的中間胚芽組織部分少見微泡聚集。沖洗之前結合率為（83.30±2.15）%，用PBS勻速沖洗后，有部分微泡被沖走，結合率為（78.30±4.36）%，沖洗前后結合率相比差異無統計學意義（P＞0.05）；對照組子宮內膜組分別沖洗前后的結合率分別為（13.30±2.58）%和（5.00±1.10）%，沖洗前后結合率相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

當使用抗β-HCG抗體預處理絨毛組織和子宮內膜組織后，TMCA與子宮絨毛組織的結合率為（16.70±2.50）%，TMCA與子宮內膜組織的結合率為(11.70±2.47)%。抗體預處理絨毛組織前后結合率相比，差異有顯著的統計學意義（P＜0.01），抗體預處理子宮內膜組織前后結合率相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

TMCA的應用是進行超聲分子顯像的物質基礎，而制備靶向微泡的關鍵技術在于微泡的表面修飾，即如何將特異度好、活性高的配體牢固結合到微泡表面。本實驗采用聚乙二醇4000作為耦聯劑增強微泡和配體的連接。聚乙二醇具有良好的柔韌性和延展性，可向外伸入周圍介質中數十納米，提高了靶向作用的穩定性；同時，濃密的短多聚鏈層也可保證微泡的穩定性，降低其非特異性結合率[8]。本實驗所選用的聲諾維超聲造影劑外有穩定的磷脂外殼，內含SF6氣體。脂質體（磷脂）以單層形式包裹微氣泡，分子的疏水端朝向氣體，親水端朝向水溶液介質，形成一道堅固的屏障，有效地避免了溶液中微泡間的相互融合[9]。由于單克隆抗體不能耐受微泡的制備過程，所以在本實驗制備TMCA的過程中直接將聲諾維混懸液和抗β－HCG抗體溶液等容積結合，4 ℃條件下靜置；利用含氣體微泡比周圍的水相輕的特點，2 h后，上層為混懸液，下層為清亮液體，經新配制的PBS懸浮3次后，所得上層混懸液，用玻片凝集實驗、免疫熒光染色實驗進行鑒定，均證明了抗β－HCG抗體可以結合聲諾維至混懸微泡表面，并且其結合率不隨時間的延長而明顯降低。此種方法成本低，操作簡單，實驗條件要求不高，不影響微泡和抗體活性，不會對微泡造成破壞，能滿足靶向超聲造影劑的早期實驗研究。

妊娠滋養細胞疾病是一組來源于胎盤絨毛滋養細胞的疾病，具高度惡性，早期可通過血行轉移至全身，因而早期定位診斷惡性滋養細胞腫瘤尤為重要。普通超聲微泡造影劑因缺乏對病變組織的特殊親和力，不能有效駐留靶組織，不利于觀察微小病變，從而有可能錯過早期發現滋養細胞侵襲血管的證據。TMCA對于靶區病變有一定的親和力，可以到達靶向區域組織或器官，選擇性地與相應的配體結合，從而達到特異的增強靶區超聲信號。本實驗中將抗β－HCG抗體連接到聲諾維的外殼上制備成TMCA，通過與妊娠絨毛組織的結合反應、子宮內膜組織對照組實驗及抗體預處理實驗，表明耦合抗β-HCG抗體的TMCA與絨毛組織在體外一定條件下能高效率、高強度，高特異性地結合。

因臨床上早期發現惡性滋養細胞疾病大多經化療后能治愈，所以很難取得子宮的大體標本；而腫瘤滋養細胞和正常妊娠的滋養細胞在許多方面仍保持不少相似之處，如都能產生HCG等糖蛋白和性激素，所以本試驗選取人工流產術后的妊娠絨毛組織作為研究對象。本實驗不足之處為所制備的TMCA在體外能與絨毛組織特異性的結合，但在實際應用中抗體介導的靶向微泡會受到血流剪切狀態的限制，大部分抗體在高剪切力的血流中不能迅速地與配體結合[10]。因此究竟在體內靶向造影劑對靶器官的作用如何，還需深入研究。

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