染料高效脫色光合細菌的分離與分析

李彥芹，昌艷萍，李春青，陳涵茜，康現江

（河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

染料高效脫色光合細菌的分離與分析

李彥芹，昌艷萍，李春青，陳涵茜，康現江

（河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

為增強染料廢水的生物處理，從印染廠的污泥中分離篩選出1株高效脫色光合細菌HL．對其在不同p H、碳源和氮源的條件下對5種染料的脫色效果進行了研究．結果表明，菌株HL菌落呈鮮紅色，圓形、光滑、濕潤、稍突起、邊緣整齊，直徑0．5～2．0 mm；個體呈螺旋狀，單根極生鞭毛，革蘭氏染色為陰性，含有細菌葉綠素a，可進行光合作用．對活性艷紅和直接胡蘭的脫色效果顯著，特別是對直接胡蘭在24 h內脫色率達到100%．菌株HL在中性環境下，分別以葡萄糖和氯化銨作為脫色培養基的碳源和氮源時，對直接胡蘭的脫色率和降解率分別達到100%和98．67%．

光合細菌；印染廢水；脫色率；降解率

印染和染料工業是現代工業中對環境污染比較嚴重的行業，其產品在生產和使用過程中大約有10%～20%的染料會直接隨廢水進入環境中［1］．染料脫色是印染廢水處理過程中關鍵的環節之一［2］，用常規生化處理技術難以達到有效脫色的目的．光合細菌可以有效地利用水中過剩的有機物作為自身繁殖的營養源，迅速分解水中氨、硫化氫、酸類等有害物質，大幅度降低水體的污染指標，在污水處理、水體凈化等方面得到廣泛關注［3－9］．

本實驗從保定某印染廠所排放的污泥中分離得到1株具有高效脫色能力的光合細菌，為光合細菌應用于實際印染工業廢水的脫色提供借鑒．

1 材料

1．1 分離樣品來源

樣品采自保定某印染廠含有染料的污泥和污水．

1．2 染料

酸性黑NG、活性艷紅、活性艷蘭、直接胡蘭、直接翠蘭，它們的最大吸收波長分別為607，520，599，616，620 nm．將5種染料在無菌操作下分別配制成質量濃度為10 mg／m L的染料溶液備用．

1．3 培養基

富集分離培養基（g／L）：NH4Cl 1．0，MgCl20．1，醋酸鈉3．0，CaCl20．1，KH2PO40．6，K2HPO40．4，酵母膏0．1，水1 L，p H 7．2，121℃ 滅菌30 min．

斜面培養基（g／L）：酵母膏10，MgSO4·7H2O 0．5，K2HPO41．0，瓊脂20，蒸餾水1 L，p H 7．0，121℃滅菌30 min．

染料培養基：添加染料的富集分離培養基．

2 方法

2．1 光合細菌的富集與分離

在無菌條件下，將采集的印染污泥和廢水以體積比1∶1混合，再與富集培養基按體積比1∶5混勻裝入三角瓶中，再加入配好的染料溶液，使染料最終質量濃度達到0．4 mg／m L，并加入已滅菌的液體石蠟（高約2 cm）形成厭氧環境，放入光照培養箱中，28～30℃，3 000 lx，培養7～15 d，待液體培養物呈現紅色或紅棕色后，取適量的富集液移至新配制的富集培養基中，進行2次富集培養（每換1次富集培養基，染料質量濃度增加1倍），重復2～3次．

采用染料固體培養基稀釋涂布法和平板劃線法進行分離，應用焦性沒食子酸法除氧［10－11］，在28～30℃，光照厭氧培養7～10 d，分離篩選具有脫色能力的菌株，轉接到斜面培養基備用．

2．2 菌株形態觀察

將分離得到的菌株轉接到未加染料的培養基上，在28～30℃，光照厭氧培養，觀察菌落形態，進行革蘭氏染色，鞭毛染色，菌體形態觀察．

2．3 菌體活細胞吸收光譜的測定

采用液體培養基，28～30℃，光照厭氧培養5 d，培養物經離心生理鹽水洗滌，將菌體懸浮于600 g／L的蔗糖溶液中，于UV 2802S紫外可見分光光度計在300～1 000 nm連續掃描［12］．

2．4 脫色率和降解率測定

脫色率的測定［13］：取適量培養液經5 000 r／min離心20 min后取上清液，以未加染料的液體培養基做空白，未接種菌體的染料培養基做對照，用722型可見光分光光度計在染料最大吸收波長下測其吸光度值，計算該菌的脫色率．

式中，A表示未接種染料培養基的最大吸光度，B表示脫色后染料培養液的最大吸光度，以脫色率表示該菌的脫色能力．

降解率的測定：用乙醇抽提法將菌體吸附的染料洗脫下來，以未加染料只加乙醇的培養基為空白，以染料培養基為對照，用722型可見光分光光度計在染料最大吸收波長測吸光度值，計算降解率．

式中，C表示加入等體積乙醇的未接種染料培養基的最大吸光光度值；D表示用乙醇洗脫后的培養液的最大吸光光度值．根據降解率大小來判斷菌株對染料的降解能力．

2．5 染料脫色后產物光譜分析

將培養液以5 000 r／min離心20 min取上層清液，以染料培養基為對照，不加染料的培養基為空白，利用UV 2802S紫外可見分光光度計在300～700 nm掃描，對染料的降解產物進行光譜分析．

2．6 p H、碳源和氮源對脫色效果的影響

在探索某因素對光合細菌脫色的影響時，采取單因素實驗法，固定其他因素條件不變，在一定范圍內改變該因素的值，30℃，3 000 lx光照厭氧培養，培養一定時間，以未接菌的染料培養基為對照，未加染料的培養基為空白，測定脫色率及降解率．

3 結果和討論

3．1 菌株形態

經過富集培養，稀釋涂布法和劃線分離法得到一株具有脫色能力的菌株HL，其菌落呈鮮紅色，圓形、光滑、濕潤、稍突起、邊緣整齊，直徑0．5～2．0 mm．革蘭氏染色為陰性，個體呈螺旋狀，單根極生鞭毛．

菌體活細胞吸收光譜測定，結果如圖1，在580，802，862 nm處都有吸收峰出現，與細菌葉綠素a的吸收波長相符，由此可表明分離出的菌株HL含有細菌葉綠素a，可進行光合作用，屬光合細菌．

圖1 HL菌株活細胞全波長掃描圖譜Fig．1 Absorption spectrum of live cell suspension of strain HL

3．2 菌株HL對幾種染料的脫色效果

將菌株HL種子液，接種到質量濃度為0．4 mg／m L的不同染料培養基中，光照厭氧培養24，48 h取樣測吸光度值，根據公式（1）計算脫色率，結果如表1．

由表1可知，菌株HL對以上5種染料都有脫色能力，其中對活性艷紅和直接胡蘭的脫色效果最顯著，特別是對直接胡蘭，在24 h內脫色率達到100%，HL對活性艷蘭和直接翠蘭的脫色效果分別只有52．43%和42．40%，酸性黑的脫色效果為69．85%．

用乙醇抽提法將菌體吸附的染料洗脫下來，根據公式（2）計算降解率，結果如表2．

表1 HL菌株對幾種染料的脫色率Tab．1 Several dye decolorization rate of strain HL

表2 HL菌株對幾種染料的降解率Tab．2 Several dye degradation rate of strain HL

由表2可知，光合細菌HL對活性艷紅和直接胡蘭有脫色能力可能是HL菌株在脫色的過程中產生某種物質與活性艷紅和直接胡蘭發生作用，改變其化學結構，使其降解．反之，活性艷蘭和直接翠蘭的降解率分別只有19．43%和13．11%，可能是被菌株HL吸附，所以很容易被乙醇洗脫下來．

3．3 代謝產物光譜分析

由脫色前后全波長掃描圖（圖2～5）可知，活性艷紅、直接胡蘭和酸性黑之所以能被菌株HL脫去顏色，是因為菌株HL在脫色過程中，破壞染料分子其原來的化學結構，本來在脫色前最大吸收波長處有峰，但是脫色后吸收峰消失了，染料被降解了．直接翠蘭不管脫色前還是脫色后最大吸收波長處都有吸收峰出現，根據圖5可得出結論，菌株HL之所以對直接翠蘭有脫色效果是吸附作用的結果．另一方面，染料被降解后可能會產生新的物質，影響到脫色率和降解率測定的準確性，將脫色前后的全波長掃描圖與表1和表2相結合可以說明染料被降解不會影響脫色率和降解率測定的結果．

圖2 活性艷紅脫色前、后的紫外－可見光譜Fig．2 Ultraviolet－visible spectrum of activity liquor before decolorization and after decolorization

圖3 直接胡蘭脫色前、后的紫外－可見光譜Fig．3 Ultraviolet－visible spectrum of directly Hulan before decolorization and after decolorization

圖4 酸性黑脫色前、后的紫外－可見光譜Fig．4 Ultraviolet－visible spectrum of acid black before decolorization and after decolorization

圖5 直接翠蘭脫色前、后的紫外－可見光譜Fig．5 Ultraviolet－visible spectrum of direct Cuilan before decolorization and after decolorization

3．4 p H、碳源和氮源對脫色效果的影響

3．4．1 p H對菌株脫色能力的影響

以直接胡蘭做脫色染料，將菌株HL轉接到不同p H的染料培養基中培養48 h，同時以未接菌的染料培養基為對照，未接種的培養基為空白，測定脫色率和降解率的結果見圖6．

圖6 p H對菌株HL脫色能力的影響Fig．6 Effect of initial p H on decolorization

由圖6可知，菌株HL在p H＜4時對直接胡蘭的脫色效果不明顯．在p H 7時，菌株HL脫色率和降解率都很高，分別是91．34%和94．69%，而且隨著p H的增大或減小，菌株對染料的脫色率和降解率也隨之下降．由此表明，光合細菌HL在p H 7時，其對直接胡蘭的脫色效果最好．

3．4．2 氮源對菌株脫色能力的影響

以直接胡蘭做脫色染料，將菌株HL轉接到不同氮源的染料培養基中培養48 h，測定脫色率和降解率的結果如表3所示．3種替代氮源都可以被菌株HL利用，各種氮源對脫色率和降解率的影響為：氯化銨＞蛋白胨＞尿素＞硝酸鈉．由此可知，菌株HL以氯化銨作為氮源對染料的脫色率和降解率最優，確定無機氮源氯化銨為菌體生長及脫色降解染料的最適氮源．

3．4．3 碳源對菌株脫色能力的影響

以直接胡蘭做脫色染料，將菌株HL轉接到不同碳源的染料培養基中培養48 h，同時以未接菌的染料培養基為對照，未接種的培養基為空白，測定脫色率和降解率的結果如表3．葡萄糖、甘露醇和醋酸鈉很容易被光合細菌HL利用，丁二酸鈉很難被菌體利用，所以菌體很難生長導致脫色率和降解率都很低．各種碳源對脫色率和降解率的影響為：葡萄糖＞甘露醇＞醋酸鈉＞丁二酸鈉．由此可知，菌株HL以葡萄糖作為碳源對染料進行脫色時測得的脫色率和降解率最優，說明這4種碳源中葡萄糖最容易被菌體HL利用．

表3 氮源、碳源對脫色率和降解率的影響Tab．3 Effect of different nitrogen and carbon sources on decolorization rate and degradation rate

4 結論

本實驗篩選出1株光合細菌HL，其菌落呈鮮紅色，革蘭氏染色為陰性，菌體為螺旋狀，含有細菌葉綠素a．

菌株HL對活性艷紅和直接胡蘭的脫色效果顯著，特別是對直接胡蘭的脫色能力在24 h內達到100%，是一株對直接胡蘭具有高效脫色能力的光合細菌．

菌株HL的脫色能力與生長同步，在中性環境下，分別以葡萄糖和氯化銨作為脫色培養基的碳源和氮源時，對直接胡蘭的脫色率和降解率分別達到100%和98．67%．

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（責任編輯：趙藏賞）

Separation and analysis of photosynthetic bacteria of high efficiency decolorization

LI Yan－qin，CHANG Yan－ping，LI Chun－qing，CHEN Han－xi，KANG Xian－jiang
（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

In order to enhance the biological treatment of dyestuff wastewater，a strain HL of photosynthetic bacteria with high efficiency on the dye decoloring ability were separated and analyzed．The effects of the strain HL on decolourization of five dyes under different conditions such as the choice of p H，carbon source and nitrogen source were studied．Results showed that the strain HL colony was bright red，circular，moist，smooth，slightly protuberant，edge tidy，diameter 0．5－2．0 mm，individual assume spiral－shaped，single extremely born flagellum，gram's staining for negative，contain bacteria chlorophyll－a for photosynthesis．And the decoloring ability were determined on the five types of dye，including on the active liquor and direct Hulan of decolorization optimal，especially for the treatment of ability within 24 h on direct Hulan was 100%．Strain HL in a neutral environment，respectively with glucose and ammonium chloride as decoloring medium carbon source and nitrogen source，the decolored rate and degradation rate of direct Hulan were 100%and 98．67%respectively．

photosynthetic bacteria；printing and dyeing wastewater；decolorization rate；degradation rate

Q939．9

A

1000－1565（2012）04－0399－07

2011－09－26

河北省自然科學基金資助項目（C2011201028）

李彥芹（1965－），女，河北滿城人，河北大學副教授，主要從事微生物和免疫學研究．E－mail：Liyanqin88＠yahoo．com．cn