ROCK對系統性紅斑狼瘡患者外周血T細胞黏附和遷移的調控*

梁柳琴， 陳偉玲， 邱 茜， 詹鐘平， 葉玉津， 楊岫巖， 許韓師

(中山大學附屬第一醫院風濕內科，廣東廣州510080)

T細胞在系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的發病機制中起著關鍵性作用。“病理性活化”的T細胞不僅啟動B細胞多克隆活化和擴增，導致高球蛋白血癥和自身抗體過度產生，而且還廣泛浸潤到多種組織和臟器，如腎臟、皮膚、中樞神經系統和關節等，從而導致組織的慢性炎癥損傷和功能失調［1－2］。T細胞由外周血進入臟器組織是一個復雜的多步驟過程，包括循環中游離的T細胞黏附到血管內皮和穿過內皮向組織遷徙。如果能夠控制T細胞的遷徙過程，則有可能減輕狼瘡的臟器損害。Rho激酶(Rho kinase，ROCK)是小分子GTP酶RhoA信號下游的一個關鍵性蛋白，廣泛參與細胞的生物學過程，特別對細胞骨架形成、黏附、遷移等細胞活動具有關鍵的調控作用［3－4］。但ROCK是否參與SLE的發病機制目前仍不清楚。為此，本文將研究SLE患者T細胞ROCK活性情況，并探討其對SLE患者T細胞黏附和遷移是否有調控作用，以期為SLE的治療尋找新思路。

材料和方法

1 研究對象

33例SLE來自于2005年6月至2010年10月中山大學附屬第一醫院風濕免疫科住院和門診患者，均符合美國風濕病學會1982年診斷標準，其中女性27例，男性6例，所有患者均未用過或停用3個月以上激素和免疫抑制劑，SLE疾病活動指數為5～18分。另設健康成年人12例作為健康對照組(healthy control，HC)，同時還有9例活動性類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)患者作為對照。

2 外周血T細胞的分離和培養

抽取患者和對照組外周靜脈血，采用RosettSep T細胞提取試劑盒(StemCell Technologies)分離T細胞，按廠家提供的實驗步驟操作。用抗CD3單抗(BD PharMingen)在流式細胞儀上檢測T細胞純度，發現T細胞純度均在95%以上。把分離得到的T細胞用RPMI－1640培養基和10%FBS(均購自Gibco)培養待用。用臺盼藍拒染法檢測細胞活性，細胞活性均超過95%。

3 提取細胞總蛋白

用冷1×PBS洗滌T細胞1次，加入50 μL SDS樣本裂解緩沖液 A(50 mmol/L Tris － HCl，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2，500 mmol/L NaCl，1%Triton X －100，0.5%去氧膽酸鈉，0.1%SDS，1 mmol/L PMSF，10 mg/L亮抑肽酶，10 mg/L抑肽酶)，勻漿后置冰上，超聲粉碎10～15 s，于95～100℃煮5 min，然后置冰上;4℃ 12 000 r/min離心5 min，吸取上清，分裝儲存于－20℃。

4 ROCK活性檢測

因為肌球蛋白磷酸酶靶亞基1(myosine phosphatase target subunit 1，MYPT1)是ROCK的主要底物之一，其磷酸化被認為是ROCK活化的重要標志，所以ROCK活性用磷酸化MYPT1蛋白表達來表示。本文采用免疫印跡法檢測磷酸化MYPT1蛋白表達。

5 免疫印跡法

把樣品蛋白于95～100℃煮5 min，然后等量上樣于15%SDS－PAGE凝膠上進行電泳，開始電壓為90 V，溴酚藍進入分離膠層時調至120 V，待溴酚藍接近至凝膠底部時停止電泳(電泳緩沖液為1×Tris－甘氨酸緩沖液，pH 7.9)，用轉移緩沖液把凝膠上蛋白質轉移至醋酸纖維膜上，膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，然后膜與不同濃度Ⅰ抗(磷酸化 MYPT1為1∶500，β －肌動蛋白為1∶2 000，均購自Santa Cruz)于4℃孵育過夜，接著膜在室溫下與Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG，1∶2 000，購自Santa Cruz)孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液顯影，最后將結果進行圖像分析，計算吸光度(A)值，ROCK活性以磷酸化MYPT1 A值與β－肌動蛋白A值之比表示。

6 T細胞黏附能力測定

T細胞(5×105)懸浮于300 μL無血清培養基，然后種植于包被有2 g/L透明質酸(hyaluronic acid，HA，購自Sigma－Aldrich)的24孔培養板，置37℃孵育15、30和60 min。根據實驗要求，部分組別細胞用Y27632(20 μmol/L，購自Chemicon)預處理30 min。孵育后，培養板用PBS沖洗3次，然后在顯微鏡(×100)下計數黏附細胞。所有樣本均設復孔。

7 T細胞遷移能力測定

T細胞的趨化性遷移實驗采用Transwell小室(直徑6.5 mm，孔徑5 μm，購自Costar)。T 細胞(5 ×105)懸浮于100 μL無血清培養基，種植于包被有2 g/L HA的Transwell小室濾網，置37℃孵育包被有2 g/L HA(購自Sigma－Aldrich)的24孔培養板，置37℃孵育30 min。把含有80 μg/L CXCL12(購自R＆D systems)的無血清培養基加至Transwell的下室，然后再于37℃孵育2 h。根據實驗要求，部分組別細胞用Y27632(20 μmol/L)預處理30 min。最后對遷移至下室的細胞進行計數。所有樣本均設復孔。

8 統計學處理

數據以均數±標準差(ˉx±s)表示，組間均數比較用t檢驗或單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 SLE患者外周血T細胞ROCK活性的檢測

新鮮分離、未行體外培養的SLE患者T細胞ROCK活性顯著高于正常對照組和類風濕關節炎患者，提示SLE患者體內外周血T細胞中ROCK活性異常增高，見圖1。

Figure 1.Measurement of ROCK activity in T cells from healthy control(HC)，rheumatoid arthritis(RA)and systemic lupus erythematosus(SLE)patients.T cells were isolated by RosettSep T cell purification kit.ROCK activity was assessed by evaluating p－MYPT1 with Western blotting analysis.ˉx±s.*P＜0.05 vs HC or RA.圖1 SLE患者外周血T細胞ROCK活性的檢測

2 SLE患者外周血T細胞體外黏附能力的檢測

如圖2所示，新鮮分離的SLE患者外周血T細胞體外黏附于HA包被膜的能力顯著高于RA患者和正常對照組。

Figure 2.Detection of in vitro adhesion of T cells from healthy control(HC)，rheumatoid arthritis(RA)and systemic lupus erythematosus(SLE)patients.ˉx±s.*P＜0.05 vs HC or RA.圖2 SLE患者外周血T細胞體外黏附能力的檢測

3 SLE患者外周血T細胞體外遷移能力的檢測

如圖3所示，在趨化因子CXCL12(80 μg/L)的誘導下，SLE患者外周血T細胞體外遷移的能力亦顯著高于RA患者和正常對照組。

Figure 3.Detection of migration of T cells from healthy control(HC)，rheumatoid arthritis(RA)and systemic lupus erythematosus(SLE)patients.Purified T cells were plated on the top chamber of a Transwell apparatus and incubated with serum－free RPMI－1640 medium for 30 min.Then RPMI－1640 supplemented with 80 μg/L CXCL12 was added into the lower chamber and incubated for 2 h at 37℃.ˉx±s.*P＜0.05 vs HC or RA.圖3 SLE患者外周血T細胞體外遷移能力的檢測

4 SLE患者T細胞黏附和遷移能力與SLE疾病活動指數(SLE disease activity index，SLEDAI)的相關性分析

如表1所示，SLE重度(SLEDAI＞15)活動組T細胞黏附和遷移能力均高于輕度(SLEDAI≤9)和中度(SLEDAI 10～15)活動組，但輕度和中度活動之間則無顯著差異。

表1 不同疾病活動度SLE患者T細胞黏附和遷移能力的比較Table 1.Comparison of adhesion and migration of T cell from SLE patients with different disease activity(ˉx±s)

5 ROCK抑制劑對SLE患者T細胞黏附能力的影響

用ROCK特異性抑制劑Y27632(20 μmol/L)預處理SLE患者T細胞30 min，然后檢測其黏附能力，結果發現，Y27632對SLE患者T細胞的體外黏附能力有顯著抑制作用，見圖4。

Figure 4.Inhibitory effect of Y27632 on adhesion of T cells from SLE patients.ˉx±s.n=9.*P＜0.05 vs non－treatment.圖4 ROCK抑制劑Y27632對SLE患者T細胞黏附的影響

6 ROCK抑制劑對SLE患者T細胞遷移的影響

用ROCK特異性抑制劑Y27632(20 μmol/L)預處理SLE患者T細胞30 min，然后在CXCL12誘導下進行遷移實驗，結果發現，Y27632顯著抑制SLE患者T細胞遷移，見圖5。

Figure 5.Inhibitory effect of Y27632 on migration of T cells from SLE patients.T cells were treated with 20 μmol/L Y27632 for 30 min.Chemotactic migration of T cells was measured as described in the legend of figure 3.ˉx±s.n=9.*P＜0.05 vs non－treatment.圖5 ROCK抑制劑Y27632對SLE患者T細胞遷移的影響

討 論

SLE是一種可出現多臟器損害的慢性炎癥性疾病，在受損的組織和臟器中出現大量的炎癥細胞浸潤，其中T細胞是主要的浸潤細胞。浸潤的T細胞直接或間接地參與局部的炎癥反應，最終導致SLE的臟器功能障礙。局部浸潤的T細胞主要來源于外周循環系統，外周血中的T細胞遷徙至局部組織要經過一個復雜的過程，除了與血管內皮功能改變有關外，T細胞本身功能如黏附、遷移能力改變也起著關鍵作用。已有報道SLE患者T細胞黏附能力較正常人明顯升高［5－6］。本研究發現，SLE患者外周血T細胞體外黏附和遷移能力顯著高于RA患者和正常對照組，提示SLE出現臟器炎癥損害與其T細胞的黏附和遷移能力異常有關，如能抑制T細胞的異常黏附和遷移可能有利于控制狼瘡的臟器損害。

Rho家族蛋白是小分子GTP酶，具有廣泛的生物學功能，特別在調節細胞遷移、黏附、信號轉導等方面具有重要作用。作為RhoA下游的關鍵信號蛋白，ROCK在轉導Rho通路活化信息方面起到舉足輕重的作用［7］。

近年研究發現，ROCK在介導外周血白細胞的黏附和遷徙方面起著重要作用。單核細胞中RhoA的過度活化可使其黏附和跨內皮遷移能力明顯增強，而Y27632能顯著抑制這種能力［8］。相似地，Y27632也抑制單核細胞趨化因子－1(MCP－1)誘導的白細胞遷移［9］。利用轉基因小鼠研究發現，敲除ROCK1基因小鼠的白細胞黏附和遷移能力顯著下降，血管壁中浸潤的白細胞明顯減少［10］。上述研究提示，抑制ROCK活化可能對調控外周血白細胞參與的局部組織炎癥具有重要作用。

在本研究中，我們發現SLE患者新鮮分離的外周血T細胞ROCK活性顯著高于類風濕關節炎患者和正常對照組，提示ROCK可能參與SLE的發病機制。進一步研究發現，ROCK特異性抑制劑Y27632對SLE患者T細胞的體外黏附和遷移均有顯著抑制作用，提示SLE患者T細胞中異常活化的ROCK可能是其T細胞發生異常黏附和遷移的關鍵調控因素之一。如上所述，T細胞在SLE的發病和臟器損害中具有舉足輕重的作用，外周血中T細胞黏附和遷徙能力的強弱對T細胞能否遷徙到臟器并在局部大量浸潤從而引起炎癥反應起到關鍵作用，通過調控T細胞遷移的關節靶點有利于抑制局部臟器的炎癥損害，因此，本文的研究結果有可能為防治SLE提供新的思路。

總之，本研究發現SLE患者外周血T細胞中ROCK處于異常活化狀態，通過抑制ROCK活化能抑制T細胞的黏附和遷移，ROCK通路很可能是調節SLE T細胞局部臟器浸潤的新靶點，抑制該通路活性可能有利于SLE的治療。但ROCK調控SLE T細胞黏附和遷移的分子機制有待進一步研究。

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