中藥資源研究常用生物信息學(xué)技術(shù)

謝騰，王升，馬炯，郭蘭萍*

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；3.北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 深圳 518055）

中藥資源研究常用生物信息學(xué)技術(shù)

謝騰1，2，王升2，馬炯3，郭蘭萍2*

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；3.北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 深圳 518055）

生物信息學(xué)的興起和快速發(fā)展在全球取得的巨大進(jìn)展和成就，為中藥資源研究提供了新的研究方法技術(shù)和思路，并且極大地推動了中藥資源的研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。綜述中藥資源研究常用的生物信息學(xué)技術(shù)，以期為中藥資源研究提供基礎(chǔ)信息和方法。

中藥資源；生物信息學(xué)技術(shù)；綜述

中藥資源（Chinese Medicinal Resources），是在一定空間范圍內(nèi)可供作為中藥使用的天然藥物及其蘊藏量的總和［1］，包括植物類資源、動物類資源和礦物類資源，是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。其中，中藥植物資源是自然界來源最廣泛的中藥資源。

作為一門新的交叉學(xué)科和工具學(xué)科，生物信息學(xué)技術(shù)在揭示中藥次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、解釋道地藥材形成的分子機(jī)制、選育抗脅迫的藥用植物和中藥鑒定新標(biāo)準(zhǔn)的建立等中藥資源研究中應(yīng)用廣泛。本文將對目前中藥資源研究常用的生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行綜述。

1 生物信息數(shù)據(jù)庫技術(shù)

數(shù)據(jù)庫是生物信息學(xué)的主要內(nèi)容和研究基礎(chǔ)，通過對這些數(shù)據(jù)的分類、收集、整理，產(chǎn)生了成千上萬的數(shù)據(jù)庫，幾乎涉及了生命科學(xué)的各個研究領(lǐng)域，如核酸序列數(shù)據(jù)庫，蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，蛋白質(zhì)、核酸、多糖的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，基因組數(shù)據(jù)庫，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫和其他種類數(shù)據(jù)庫。目前應(yīng)用比較廣泛的數(shù)據(jù)庫有：GenBank、EMBL、DDBJ等核酸序列數(shù)據(jù)庫和 PIR、MIPS、Swiss-Prot等蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。

以藥用植物名為檢索詞，在GenBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genbank／）檢索了截至 2012年5月64個常見中草藥品種，于表1記錄了核苷酸序列注冊情況，并舉例了生物信息研究常見的核酸序列、GenBank登錄號以及序列的長度。

表1 GenBank數(shù)據(jù)庫中64個常見中草藥品種核苷酸序列注冊情況和序列舉例

續(xù)表1

2 生物芯片

生物芯片是指通過微電子和微加工技術(shù)在固相基質(zhì)表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，通過檢測集成在芯片上的分析微陣列，來分析細(xì)胞及其他的生物分子，快速獲取樣品的生物信息，也稱為微點陣（Micro Array）技術(shù)［2］。生物芯片技術(shù)具有高信息量、快速、微型化、自動化、成本低、污染少、用途廣等特點［3］。常見的生物芯片有：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、糖芯片和芯片實驗室等［4］。

目前生物芯片技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于包括擬南芥、水稻、玉米、番茄、草莓、松樹、大豆、白楊等植物物種中［5］，新的芯片技術(shù)例如質(zhì)子束直寫技術(shù)［6］以及新型生物芯片例如數(shù)字微流控芯片［7-8］、三維生物芯片［9］和低成本的一次性塑料生物芯片［10］等是近年生物芯片研究的熱點。

生物芯片技術(shù)雖尚處于幼年階段，仍然有許多需要改進(jìn)的地方，但芯片技術(shù)以其連續(xù)化、集成化、微型化的優(yōu)勢為科學(xué)家們所青睞，在植物科學(xué)領(lǐng)域迅速應(yīng)用。

生物芯片在植物方面的應(yīng)用主要集中在：基因表達(dá)檢測與新基因的發(fā)現(xiàn)；植物分子病理中的研究［11］；植物逆境和營養(yǎng)方面的研究；轉(zhuǎn)基因植物檢測及植物檢疫等方面，也為道地藥材科學(xué)內(nèi)涵的闡述提供了強(qiáng)有力的工具。丹參道地藥材cDNA芯片的構(gòu)建是以傳統(tǒng)藥用植物和道地藥材為研究主題的首張芯片，得到的114個在丹參毛狀根不同時期差異表達(dá)的獨立基因（Unigone）中有52個為丹參中首次報道［12］。在藥材的鑒定方面，李紹平等［13］對川貝母、浙貝母、皖貝母和湖北貝母4種主要貝母品種進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，以川貝母特有堿基序列cTITFGTcGQ TcA為探針制成的芯片，可準(zhǔn)確鑒定川貝母［14］。

3 測序技術(shù)

DNA測序技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中基本的手段之一，它的出現(xiàn)極大地推動了生物學(xué)的發(fā)展。表2是對三代測序技術(shù)比較全面的概括和比較。

表2 三代測序技術(shù)的比較

DNA是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，包含著生命發(fā)生發(fā)展的遺傳特征，是道地藥材分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)［15］。小分子RNA如miRNA和siRNA等介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控是植物中的一種新型基因調(diào)控機(jī)制，在植物生長、發(fā)育以及應(yīng)答外界脅迫等方面起到重要作用［16］。植物葉綠體基因組獨立于核基因組，屬于母系遺傳，具有高度的保守性和生物轉(zhuǎn)化的性狀穩(wěn)定性，物種進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育分析研究也是道地藥材研究的重要方向。

作為最重要的分子生物學(xué)分析方法之一，高通量測序技術(shù)在植物DNA、小分子RNA以及葉綠體DNA等方面的測序發(fā)展快速，表3中收錄了近年已發(fā)表的采用高通量測序的部分物種，其中多種物種基因組序列密碼解析過程中都采用了新一代測序技術(shù)［17］。

表3 使用高通量測序的部分藥用植物和常見植物

4 EST

表達(dá)序列（Expressed Sequence）是指基因組表達(dá)為RNA的序列，ESTs（Expressed Sequence Tags）是從已建好的cDNA庫中隨機(jī)取出一個克隆，從5’末端或3’末端對插入的cDNA片段進(jìn)行一輪單向自動測序，所獲得的約60～500 bp的一段cDNA序列。ESTs是cDNA克隆的一部分序列，攜帶了表達(dá)基因的部分遺傳序列，具有組織特異性。EST獲得快速、簡便且廉價，是研究基因表達(dá)最有用的材料和基因組學(xué)的主要內(nèi)容，廣泛地應(yīng)用于基因組物理圖譜的繪制、基因識別、基因表達(dá)譜的構(gòu)建和新基因的發(fā)現(xiàn)等研究方向［30］。為了方便研究，表4給出了常用的EST數(shù)據(jù)庫及其網(wǎng)站。

表4 常用的EST數(shù)據(jù)庫

對EST數(shù)據(jù)的分析包括聚類前處理（pre－Processing）、聚類（Clustering）、拼接（Assembly）和分析Analysis）。數(shù)據(jù)聚類分析對于EST的功能識別、剪接產(chǎn)物的區(qū)分、基因表達(dá)譜的分析都有很大的幫助，經(jīng)聚類和裝配得到的唯一序列代表了對所研究的物種（組織）在某一特定時間所表達(dá)的基因的隨機(jī)采樣的結(jié)果［31］。為了方便研究，表5給出了常用EST聚類和拼接軟件，并從四個方面作了比較。此外 SequencherTM、Repeatmasker、Seqclean、Esttrimmer、Contig Express等也用來做EST聚類。

表5 常用EST聚類和拼接軟件比較

EST技術(shù)作為基因組學(xué)、功能基因組學(xué)與后基因組學(xué)之間的橋梁，已成為分子生物學(xué)研究的有力工具。EST技術(shù)最基本的方法就是建立EST數(shù)據(jù)庫。利用ESTs技術(shù)建立基因數(shù)據(jù)庫的其他藥用植物還有人參、薄荷、丹參、銀杏、甘草、長春花［32］、藏紅花［33］等。

EST數(shù)據(jù)庫在藥用植物研究方面的另一重要用途是鑒別和發(fā)現(xiàn)藥用植物代謝途徑中的新基因為道地藥材遺傳多樣性、性狀關(guān)聯(lián)基因標(biāo)記、藥材真?zhèn)魏推焚|(zhì)優(yōu)劣的鑒別［34］等提供新的技術(shù)手段。

EST的測序方法存在一定的誤差（精確度為97%），目前dbEST數(shù)據(jù)庫中EST并不精確，EST技術(shù)所獲得的也只是一種模擬序列，只能作為參考，對結(jié)果的最終確認(rèn)還要通過實驗驗證。盡管如此，EST仍然是獲取生物信息快捷和經(jīng)濟(jì)的方法。圖1給出了截至2012年5月，對30個常見中藥藥用植物以藥用植物名為檢索詞，檢索并統(tǒng)計其在dbEST（ http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／projects／dbEST／）中EST的注冊情況。

圖1 部分中藥藥用植物在dbEST中注冊EST的情況

5 序列比對

生物信息學(xué)分析方法種類繁多，但最基本的分析方法是以數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)的序列比對、新序列的識別、結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測以及軟件的研制等［35］。序列的比對是生物學(xué)中最為基礎(chǔ)的一個部分。最常見的比對是蛋白質(zhì)序列之間或核酸序列之間的兩兩比對。

通過分析序列之間的相似和差異，尋找二者可能的保守區(qū)域、位點，探索產(chǎn)生共同功能的序列模式。常用的序列比對方法有雙序列比對和多序列比對。表6提供了常用的序列比對軟件和網(wǎng)址，且所提供的軟件均適用于蛋白質(zhì)和DNA序列的比對。

隨著DNA測序技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA序列分析在藥用植物的分類和系統(tǒng)關(guān)系、鑒定、道地性以及序列變異與藥用成分的關(guān)系等方面開始得到了應(yīng)用，在推進(jìn)中藥現(xiàn)代化等諸多方面展示出廣闊的應(yīng)用前景，為道地藥材的研究注入了新的活力［36］。

表6 常用序列比對分析軟件

基于DNA測序和序列比對的DNA條形碼（DNA barcoding）是近年來分子生藥鑒定的研究熱點和方向。DNA條形碼最早是2003年由加拿大動物學(xué)家Hebert提出［37］，陳士林等［38］認(rèn)為 DNA條形碼技術(shù)在藥用植物鑒定中的成功應(yīng)用是中藥鑒定方法的革命性突破。目前，道地藥材分子鑒定涉及到栝樓［39］、川烏［40］、草烏［40］、人參［41］、柴胡［42，43］、木瓜［44］、地龍［45］、威靈仙［46］、芍藥［46］、土茯苓［46］、浙貝母［47］、丹皮［48］、金銀花［49］、金釵石斛［50］、小茴香［51］、山 藥［52］、京 大 戟［53］、金 錢 草［54］、天 胡荽［54］、過 路 黃［54］、 陽 春 砂［55］、 草 果［55］、 黃 花蒿［56］、天門冬［57］、石豆蘭屬［58］、廣藿香［59］等諸多生藥。

陳士林等學(xué)者［60-61］提出了將ITS2作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列的觀點，并在后續(xù)的研究中得到不斷論證。金錢白花蛇、烏梢蛇及酒烏梢蛇、蘄蛇及酒蘄蛇的分子鑒定方法應(yīng)用于2010年版 《中國藥典》［62］，這是 《中國藥典》首次采用分子標(biāo)記方法鑒定藥材。

在蛇床子［63］6個居群的葉綠體matK基因測序分析研究中發(fā)現(xiàn)蛇床子居群間的親緣關(guān)系與地理分布及所含香豆素化學(xué)型呈明顯的相關(guān)性。對廣藿香［64］基因序列（18SrDNA、matK基因）分析也得到類似的相關(guān)性。李萍等［49］對金銀花不同居群5SrDNA基因間區(qū)的測序分析結(jié)果與邢俊波等［65］對綠原酸含量的分析結(jié)果相一致，認(rèn)為基因的差異是金銀花藥材道地性的因素之一。蔡朝暉等［47］發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地浙貝母的5SrDNA基因間區(qū)具有相同的堿基序列，總生物堿含量相當(dāng)且含有相同的單體生物堿，因此認(rèn)為不同產(chǎn)地浙貝母的差異不是由堿基序列引起，而是小環(huán)境因素造成的。

此外，ITS序列分析也被用于分析不同居群的遺傳差異，鐵皮石斛［66］、山參［67］、太子參［68］、陽春砂［69］等的DNA序列分析結(jié)果顯示ITS序列差異與居群類型存在相關(guān)性。

6 生物云計算

生物云計算（Biological Cloud Computing）是基于云計算（Cloud Computing）的新興生物信息學(xué)工具，將生物信息計算能力作為一種商品通過互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行流通，為龐大的生物信息計算提供了強(qiáng)大的計算能力，在降低計算成本的同時也提高了研發(fā)效率。

集成云計算面向服務(wù)的多自主體系統(tǒng)（CISM，Cloud Computing Integrated into Service-Oriented Multi-Agent）架構(gòu)允許發(fā)展動態(tài)、分布式和高度可擴(kuò)展的生物信息軟件［70］。MapReduce、MPI和云計算在Alu重復(fù)序列和EST構(gòu)建中的表現(xiàn)得出：云技術(shù)在處理大型數(shù)據(jù)集、移動數(shù)據(jù)等方面可以達(dá)到簡化的效果［71］。此外，生物云計算平臺的搭建也有相關(guān)的報道，如基于水稻功能組學(xué)研究的TTRSIS的建設(shè)［72］和基于植物科學(xué) iPlant Atmosphere的提出［73］等。

目前比較成熟而實用的云計算產(chǎn)品有IBM藍(lán)云、亞馬遜Amazon EC2、谷歌Google A PPEngine、微軟Windows Azure，以及后起之秀紅帽云計算服務(wù)。

7 系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育學(xué)也稱系統(tǒng)發(fā)生學(xué)（Phylogeny），是基于分子數(shù)據(jù)差異（不同的基因或DNA片段它們之間存在的進(jìn)化速率差異）來研究物種的形成或進(jìn)化過程和機(jī)制，以及物種之間的進(jìn)化關(guān)系的一門學(xué)科，是生物信息學(xué)的一個重要分支。在中藥資源的研究中通過系統(tǒng)發(fā)育研究，可以探討植物的分類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以及進(jìn)化的過程和機(jī)制，可以了解物種間的進(jìn)化關(guān)系和歷史，探索物種的起源和未知基因的功能，進(jìn)行藥材差異性研究和微生物生態(tài)學(xué)的研究。

基于分子水平的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法可以分為四大類：（1）基于字符序列的方法：最大簡約法／M P；最大似然法／ML）；貝葉斯法／Bayesian。（2）基于距離的算法是目前應(yīng)用最廣的一類系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法。其理論基礎(chǔ)是最小進(jìn)化原理（mini-mum evolution，ME）。兩個經(jīng)典算法是平均連接聚類法／UPGMAU）和鄰接法／NJ。此外還有FM法。（3）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法不再以距離矩陣為輸入數(shù)據(jù)，而是以序列為輸入數(shù)據(jù)，通過網(wǎng)絡(luò)對序列地不斷學(xué)習(xí)，自適應(yīng)生成系統(tǒng)發(fā)育樹。（4）基于圖形表示的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建方法。表7給出了常用的幾種系統(tǒng)發(fā)育分析軟件以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法。

表7 常用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件

系統(tǒng)發(fā)育分析后，通過一種分支圖表即進(jìn)化樹來反映同一譜系的進(jìn)化關(guān)系。目前經(jīng)常使用到的部分系統(tǒng)發(fā)育分析軟件如表7所示?？梢愿鶕?jù)不同的研究目的，采用不同的序列片段來探究系統(tǒng)發(fā)育問題，但是通過計算機(jī)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹只是一個物種進(jìn)化的模型，并不一定完全符合自然界真實的物種進(jìn)化規(guī)律。表8列舉了近年進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析部分的植物，以及所采用的系統(tǒng)發(fā)育方法和軟件。

表8 植物系統(tǒng)發(fā)育分析研究舉例

生物信息學(xué)技術(shù)在中藥資源研究中應(yīng)用日趨廣泛和深入，不過生物信息學(xué)技術(shù)在中藥資源領(lǐng)域的應(yīng)用總的來說還未成熟，只是處在初生階段，相關(guān)研究還是零散的，并不成系統(tǒng)，目前也沒有中藥資源的生物信息數(shù)據(jù)庫的建立，不過生物信息學(xué)技術(shù)未來在揭示中藥資源生物學(xué)規(guī)律將發(fā)揮更大作用。

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App lications of Common Bioinformatics Technology in Study of Chinese M edicinal Resources

XIE Teng1，2，WANG Sheng2，MA Jiong3，GUO Lan-ping2
（1.School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu610031，China；2.Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China；3.The School of Environment and Energy，Peking University Graduate School in Shenzhen，Shenzhen518055，China）

Bioinformatics，arising in the late 20th century，is one of themajor frontiers of life sciences and natural sciences of this century.Extensive applications of bioinformatics in life science research field result in huge economic and social benefits.Chinesemedicinal resources including plant，animal，and mineral are the basis of the development of Chinesemedicine industry.Among them，Chinesemedicinal plant resource is natural source and is the most widely used Chinese medicine resources.The rise and rapid development of bioinformatics have made great progress and achievements in theworld，provided new research ideas to the study of Chinesemedicine resources，and greatly promoted the study of Chinese medicine resources and industrial development.This review gives a comprehensive collection and analysis of the application of bioinformatics in the study of Chinese medicine resources and an outlook of bioinformatics，so as to provide the basic information and ideas for the study of it.

Chinesemedicinal resources；Bioinformatics Technology；Summary

*［通訊作者］郭蘭萍，Tel：（010）64011944，E-mail：glp01＠126.com