火絨草抑菌作用的物質基礎研究△

姜鴻，單國順，齊越，趙玥，尤獻民

（遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034）

中藥科技

火絨草抑菌作用的物質基礎研究△

姜鴻*，單國順，齊越，趙玥，尤獻民

（遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034）

目的：探討中藥材火絨草抑菌作用的藥效物質基礎。方法采用SPSS統計分析方法，以36個色譜峰的相對峰面積為自變量，提取物的抑菌圈直徑為因變量進行相關性分析和回歸分析。結果得到36個色譜峰的相關系數。結論：初步確定火絨草中與16個色譜峰對應的化學組分具有抑菌活性，其中色譜峰X10為原兒茶酸，X13為原兒茶醛，X14為綠原酸，X16為咖啡酸。

火絨草；物質基礎；相關分析；回歸分析；抑菌作用

火絨草Leontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.為菊科火絨草屬植物的干燥全草，味微苦，性寒；入腎、膀胱二經；具有清熱涼血，消炎利腎的功效。對流行性感冒，急、慢性腎炎，尿路感染，尿血，創傷出血等癥狀有一定的療效。火絨草具有抑菌作用已有報道［1］，但是其抑菌活性成分的研究未見報道。

本研究利用極性萃取法將火絨草提取液分成不同極性化學組分，對其不同化學組分進行體外抑菌試驗，并與各提取物指紋圖譜相對峰面積相關聯，使用SPSS統計軟件進行相關性和回歸分析，初步確定火絨草中的抑菌活性物質，為火絨草抑菌藥效物質基礎的深入研究奠定理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜分析儀：四元泵、DAD檢測器、全自動進樣器Agilent公司。電熱恒溫培養箱（廈門醫療電子儀器廠）；電子數顯卡尺（桂林廣陸數字測控股份有限公司）。

1.2 材料

原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110809-200604， 110810-200506， 110753-200413， 110885-200102）；乙腈、磷酸為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純；火絨草藥材采自沈陽東陵祝家地區，經遼寧中醫藥大學藥用植物教研室王冰教授鑒定為火絨草Leontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.。

MH（Mueller-Hinton）瓊脂培養基，血瓊脂培養基（溫州市康泰生物科技有限公司）。金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、痢疾志賀菌、白色念珠菌（遼寧省臨床檢驗中心）。

提取物制備：取火絨草藥材1 000 g，去雜質，加18 000 mL水提取2次，每次1 h，量取1／2倍體積的提取液，減壓干燥；剩余提取液置分液漏斗中，分別用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各萃取3次，合并萃取液，減壓干燥；取經過上述溶劑萃取后的水溶液，減壓濃縮至干。將5份提取物稱重后粉碎，分別用糊精配制質量濃度為藥材－糊精（10∶1）的1號提取物（水提物）、2號提取物（石油醚提取物）、3號提取物（乙酸乙酯提取物）、4號提取物（正丁醇提取物）和5號提取物（剩余提取物）。

2 方法與結果

2.1 提取物指紋圖譜分析

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A：0.2%磷酸水溶液，B：乙腈；梯度洗脫。流速：1 mL·min－1；檢測波長：290 nm；柱溫：25℃；記錄60 min譜圖。

2.1.2 供試品溶液制備 分別準確稱取1～5號提取物各2 g，加蒸餾水50mL，稱重。回流提取1 h，靜置冷卻至室溫，稱重，用蒸餾水補足失重，搖勻，經0.45μm濾膜濾過，分別取續濾液作為供試品溶液。

2.1.3 HPLC指紋圖譜分析 取各供試品溶液，在上述色譜條件下進樣，5個提取物以提取物1為準共得到36個色譜峰，見圖1～5，用X1～X36分別代表各色譜峰校正后的峰面積。

圖1 1號提取物的HPLC指紋圖譜

圖2 2號提取物的HPLC指紋圖譜

圖3 3號提取物的HPLC指紋圖譜

圖4 4號提取物的HPLC指紋圖譜

圖5 5號提取物的HPLC指紋圖譜

將原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸和咖啡酸混合對照溶液進樣，記錄色譜圖，并將保留時間與樣品各指紋峰比較，確認10、13、14、16號峰分別為原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸，見圖6。

2.2 抑菌試驗

2.2.1 試驗方法 提取物分別用無菌蒸餾水配制成0.4 g·mL－1。將供試細菌的新鮮菌苔用白金耳接種至瓊脂培養基，36.5℃恒溫培養18 h后，將細菌溶于2 mL 0.9%氯化鈉溶液中，配制成濁度為0.5的菌懸液。用無菌棉簽蘸取0.1 mL菌懸液，均勻涂布于MH瓊脂培養基及血瓊脂培養基表面，用直徑為8 mm的無菌打孔器在培養基上垂直方向打4個孔，相鄰兩孔的距離大于3 cm。每個平皿內分別加提取物藥液、蒸餾水作為陰性對照，加兩孔作為平行樣，各做2個平皿，每孔加0.2mL藥液，36.5℃恒溫培養18 h。采用 “十字交叉”法測量抑菌圈直徑，計算抑菌圈直徑的平均值［2-3］。

2.2.2 提取物對供試菌株的抑菌作用 實驗結果表明，肺炎鏈球菌、白色念珠菌對上述提取物均不敏感；金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、痢疾志賀菌對1、3、4、5號提取物表現為高度敏感（抑菌圈直徑＞19 mm）或中度敏感（抑菌圈直徑介于13～19 mm）［3］。結果見表1。

從實驗結果可知，火絨草藥材具有較強的抑菌作用，對許多致病菌，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、痢疾志賀菌等具有明顯的抑制作用，這一結果也與文獻報道相符。

2.2.3 數據統計 將指紋圖譜化學數據和抑菌試驗數據組成原始數據矩陣，自變量X1～X36代表各色譜峰校正后的峰面積，因變量Y1～Y6分別代表金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、痢疾志賀菌的抑菌圈直徑，組成矩陣，采用SPSS軟件進行數據處理，采用相關分析的方法探討火絨草藥材中抑菌的藥效物質基礎［4］。

2.2.4 相關分析 相關分析Correlate是研究變量之間密切程度的一種統計方法，當分析多個變量之間的關系，而這種關系又往往是變量之間的數量關系時，通常采用雙變量Bivariate相關分析方法。使用SPSS軟件（13.0版）中的雙變量相關分析可以得到變量兩兩之間的皮爾遜系數（Pearson Correlation Coefficients）及其統計量。

表1 提取物對供試菌株的抑菌作用（n＝6）／mm

與Y1密切正相關的變量有：X11、X14、X16、X24、X25、X28、X30、X34；與 Y2密切正相關的變量有：X7、X11、X13、X14、X16、X24、X25、X28、X30、X31、X34、X35、X36；與 Y3密切正相關的變量有：X14、X16、X25、X35、X36；與 Y4密切正相關的變量有：X7、X14、X16、X28、X31、X36；與 Y5密切正相關的變量有：X13、X14、X24、X28、X34、X35；與 Y6密切正相關的變量有：X14、X16、X25、X35、X36。與這些色譜峰對應的化學成分可能是有效抑菌成分。

2.2.5 回歸分析 采用 “有進有出”的回歸分析方法，從一個自變量開始，視各自變量X對因變量Y作用程度的顯著，將顯著變量逐個引入回歸方程，而原引入的變量因后引入的新變量而變得不顯著時，則將其剔除，每一步都進行F檢驗，以保證方程中只包含顯著變量。這個過程反復進行直到再無新變量引入，也無變量被剔除，逐步回歸完成，建立回歸方程。共有 X5、X14、X16、X17、X24、X28、X31、X36等20個變量被引入回歸方程，其中X5、X17與提取物的抑菌作用呈負相關，與藥效預期的結果相反，因此被剔除。在分析過程中同時發現有多重共線性情 況， 變 量 X7、X10、X11、X13、X18、X21、X25、X30、X34、X35與被引入的變量的相關系數接近1，且這些組分與Y值呈正相關，因此這10個化學組分可能是火絨草抑菌的藥效物質。

經過相關和回歸分析，可初步確定 X7、X10、X11、X13、X14、X16、X18、X21、X24、X25、X28、X30、X31、X34、X35、X36為火絨草抑菌的藥效物質基礎。

3 討論

中藥藥效物質基礎是中藥現代化的研究核心，以中藥的主要功效和配伍理論為指導，采用恰當的藥理模型評價藥效，利用現代分離、分析技術篩選、提取、分離與藥效密切相關的化學成分群，進而闡明化學成分與藥理活性的關系，確定中藥藥效物質基礎，是中藥現代化基礎研究的主要內容。

本研究將指紋圖譜技術運用于復雜成分的化學信息采集，將化學信息與藥理實驗結果相關聯，對關聯結果進行降維處理，得出與藥效相關性比較大的少數組分作為藥效物質基礎，探索了中藥藥效物質基礎研究的思路。綜上所述，研究了中藥火絨草的色譜指紋圖譜和抑菌藥效物質基礎，初步將36個色譜峰中的16個確定為火絨草抑菌藥效物質基礎。本研究對中藥藥效物質基礎研究進行了有意義的探索，對中藥復方藥效物質基礎研究也有一定的借鑒意義。

中藥材及中藥復方藥效物質基礎研究是中醫藥現代研究的難點，主要體現在其化學成分的復雜性上，中藥及其復方的化學成分通常有數十甚至上百種，而且藥材來源、加工工藝、藥味加減、劑量和配比等因素也會直接影響中藥復方化學組成以及中藥及其復方的療效。目前，中藥物質基礎研究思路和研究方法尚不成熟，現有的研究方法主要有：傳統的化學研究方法、拆方研究、中藥有效部位研究、中藥指紋圖譜的研究、中藥血清藥物化學研究、代謝物組學、細胞膜生物色譜法等。我們采用中藥指紋圖譜化學信息與藥理實驗結果相關聯的方法，確定了中藥材具有藥效作用的化學成分，為有效成分分離、鑒定及其藥效作用的確定提供理論指導，是中藥材及中藥復方藥效物質基礎研究的有效手段。

［1］黃利權，伍義行.火絨草的抗菌活性研究［J］.中獸醫醫藥雜志，2006，（1）：5-7.

［2］伍義行，王建國.火絨草抑菌作用試驗研究［J］.時珍國醫國藥，2000，11（4）：289-290.

［3］陳林娜，周立勤，王漢敏，等.中藥對臨床耐藥菌株的體外抑菌試驗觀察［J］.中華醫院感染學雜志，2005，15（1）：118-120.

［4］沈嵐，張梁，馮怡，等.芍藥甘草復方效應組分譜效關系研究［J］.中國中藥雜志，2009，33（22）：2658-2662.

Study on Antibacterial Substances in Leontopodium leontopodioides（W illd.）Beauv.

JIANG Hong，SHAN Guo-shun，QIYue，ZHAO Yue，YOU Xian-min（Medical Research Institute of Liaoning Province，Shenyang110034，China）

Objective：Study on the antibacterial pharmacodynaic material inLeontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv..M ethods：SPSS statistical analysismethod was used for correlation and regression analysis by the relative area of 36 chromatographic peaks as independent variables，and bacteriostatic ring diameter of extracts as dependent variables.Results：Correlation coefficients of 36 chromatographic peaks were got.Conclusion：Chemical constituents inLeontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.corresponding with 16 chromatographic peaks were preliminary determined having antibacterial activity，in which，chromatographic peak X10is protocatechuic acid，X13is protocatechuic aldehhye，X14is chlorogenic acid，and X16is caffeic acid.

Leontopodium leontopodioides（Willd.） Beauv.；Material basis；Correlation analysis；Regression analysis；Antibacterial action

△［基金項目］遼寧省科技廳項目（2007403019）

*［通訊作者］姜鴻，Tel：（024）86803184，E-mail：jh0723＠126.com

2012-03-22）