聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制劑治療大鼠急性脊髓損傷效果觀察

馮新民,李小磊,陶玉平,楊建東,王永祥,王靜成

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院江蘇省蘇北人民醫(yī)院脊柱外科,江蘇揚(yáng)州,225001)

急性脊髓損傷(SCI)是脊柱骨折的嚴(yán)重并發(fā)癥,其神經(jīng)功能恢復(fù)一直是脊柱外科領(lǐng)域研究的難點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)他克莫司(FK506)和FTY720對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)有較好的效果,為脊髓損傷的治療開(kāi)辟了新視野[1-3]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察大鼠急性脊髓損傷后早期聯(lián)合使用FK506和FTY720對(duì)神經(jīng)組織是否起保護(hù)作用。

1 材料與方法

選取84只Wsitar大鼠,由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體質(zhì)量 220～280 g,分成4組:FK506+FTY720聯(lián)合治療組(A組,24只)、FK506治療組(B組,24只),脊髓損傷組(C組,24只)和正常對(duì)照組(D組,12只)。采用Allen打擊模型建立脊髓損傷模型:麻醉成功后切除大鼠T9、T10椎板,重10 g的鐵球從4 cm 高度落下,打擊硬膜囊后,大鼠出現(xiàn)搖尾反射,顯示脊髓損傷模型建立成功。A組一次性通過(guò)尾靜脈注射0.3 mg/kg FK506,并予鼻飼0.3 mg/kg FTY720,B組一次性通過(guò)尾靜脈注射0.5 mg/kg FK506,C組注射生理鹽水。對(duì)照組僅僅做椎板切除。術(shù)后分籠飼養(yǎng),定時(shí)按壓膀胱排尿。

分別于術(shù)后第6、24和48小時(shí)取材,對(duì)照組選取3只,其他每組選取6只大鼠。大鼠予以過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死后,取出手術(shù)段脊髓,在10%的甲醛溶液中固定24 h后,埋蠟,切片,每個(gè)組切片5張備用。隨機(jī)從各組各時(shí)間點(diǎn)選取切片3張,行蘇木精-伊紅染色法(HE染色)后在光鏡下觀察各組大鼠損傷脊髓組織病理變化。

從各組各時(shí)間點(diǎn)剩下的連續(xù)切片中隨機(jī)抽取2張,參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 TUNEL法染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞。切片經(jīng)過(guò)組織固定、脫蠟、水化、洗滌、抗原修復(fù)之后,每個(gè)樣本滴加100 μL TdT酶反應(yīng)液,避光濕潤(rùn)37℃反應(yīng)1 h,其次洗滌、加酶標(biāo)親和素、DAB法顯色、復(fù)染,最后中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察:凋亡細(xì)胞為棕色,正常細(xì)胞為藍(lán)紫色統(tǒng)計(jì)方法:計(jì)算出細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

所有動(dòng)物在淺麻醉下處于睜眼、清醒、四肢肌力下降等狀態(tài),采用肌電誘發(fā)電位儀檢測(cè)SEP潛伏期,刺激和記錄電極均采用針電極,將電極置于脛前中份肌肉內(nèi),參考電極遠(yuǎn)側(cè)1 cm處,刺激強(qiáng)度3～6 mA,以引起下肢明顯抖動(dòng)為宜,記錄術(shù)前術(shù)后的SEP的潛伏期變化情況。術(shù)后的記錄時(shí)間點(diǎn)為第1、3和7天。

采用斜板試驗(yàn)和BBB評(píng)分法對(duì)各組大鼠脊髓損傷后的行為及后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)定。對(duì)照組取3只,其他各組各取6只,分別在術(shù)后第1、3、7和14天測(cè)定,每項(xiàng)指標(biāo)共測(cè)定3次,以平均值為準(zhǔn)。BBB評(píng)分者為非本實(shí)驗(yàn)組人員且熟知評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。評(píng)分前所有動(dòng)物均排空膀胱,防止因膀胱充盈而影響活動(dòng)。

2 結(jié) 果

對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)清晰,未見(jiàn)出血壞死、組織水腫或者變性等情況。損傷組SCI后第6小時(shí),可見(jiàn)明顯組織損傷,SCI區(qū)結(jié)構(gòu)破壞,模糊不清,中央管出血,灰質(zhì)多灶性出血,白質(zhì)中偶見(jiàn)小片出血;神經(jīng)元腫脹、壞死,神經(jīng)纖維水腫,部分結(jié)構(gòu)模糊不清。SCI后第24小時(shí),可見(jiàn)脊髓組織切片發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)主要位于脊髓灰質(zhì),在損傷區(qū)中央灰質(zhì)可見(jiàn)大片出血、細(xì)胞腫脹、尼氏體消失,細(xì)胞空泡變性、部分細(xì)胞核固縮,并有大量單核或多核炎性細(xì)胞浸潤(rùn),有些損傷脊髓組織可出現(xiàn)囊腔樣變化。傷后第48小時(shí),灰質(zhì)被明顯破壞,損傷中心見(jiàn)壞死空腔形成,殘留周邊部分白質(zhì)。聯(lián)合治療組和FK506治療組大鼠光鏡下觀察的病理學(xué)表現(xiàn)較損傷組輕,并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),正常的神經(jīng)元細(xì)胞多于損傷組,在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)上神經(jīng)元、灰白質(zhì)破壞的情況要輕于損傷組。

對(duì)照組罕見(jiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,損傷組、聯(lián)合治療組和FK506治療組在傷后第6小時(shí)可見(jiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,在傷后第24小時(shí)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到高峰;隨后逐漸減少,至本實(shí)驗(yàn)觀察末期第48小時(shí)仍然可見(jiàn)陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。聯(lián)合治療組和FK506治療組在各個(gè)采集時(shí)間的陽(yáng)性率均低于損失組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但聯(lián)合治療組和FK506組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織凋亡率的比較(,%)

表1 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織凋亡率的比較(,%)

與對(duì)照組相比,#P<0.05;與損傷組相比,#P<0.05。

分組 n 第6小時(shí) 第24小時(shí) 第48小時(shí)聯(lián)合治療組 6 15.19±2.01＊# 24.22±4.72＊# 13.22±1.32＊#FK506組 6 15.48±1.21＊# 24.40±5.26＊# 13.36±1.25＊#損傷組 6 23.04±3.49＊ 34.18±3.95＊ 18.65±1.16#對(duì)照組 3 1.28±0.36 1.01±0.21 0.88±0.04

聯(lián)合治療組、FK506治療組和損傷組的SEP在術(shù)后均高于對(duì)照組,有顯著性差異(P<0.05)。聯(lián)合治療組和FK506治療組術(shù)后第1、3、7天潛伏期與損傷組比較均有顯著性差異(P<0.05),但是聯(lián)合治療組和FK506治療組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合治療組和FK506治療組的潛伏期隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠術(shù)后潛伏期的比較(,ms)

表2 3組大鼠術(shù)后潛伏期的比較(,ms)

與對(duì)照組相比,＊P<0.05;與損傷組相比,#P<0.05。

分組 n 術(shù)后第1天 術(shù)后第3天 術(shù)后第7天聯(lián)合治療組 6 10.67±0.44＊# 9.24±0.21＊# 8.02±0.18＊#FK506組 6 10.88±0.64＊# 9.40±0.34＊# 8.28±0.27＊#損傷組 6 11.96±0.13＊ 10.81±0.32＊ 10.12±0.23＊對(duì)照組 3 3.75±0.11 3.72±0.08 3.69±0.15

損傷組、聯(lián)合治療組和FK506治療組在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分均小于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3、4。損傷組、聯(lián)合治療組和FK506治療組大鼠在術(shù)后雙后肢肌力完全喪失,并且出現(xiàn)尿潴留和脊髓休克癥狀。術(shù)后第3天開(kāi)始,聯(lián)合治療組和FK506治療組大鼠的上述兩項(xiàng)評(píng)分開(kāi)始高于損傷組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但聯(lián)合治療組和FK506治療組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分結(jié)果比較(,分)

表3 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分結(jié)果比較(,分)

與對(duì)照組相比,＊P<0.05;與損傷組相比,#P<0.05。

分組 n 術(shù)后第1天 術(shù)后第3天 術(shù)后第7天 術(shù)后第14天聯(lián)合治療組 6 1.76±0.25＊# 3.59±0.24＊# 8.08±0.92＊# 15.13±0.86＊#FK506組 6 1.73±0.45＊# 3.50±0.84＊# 7.88±1.07＊# 14.91±1.15＊#損傷組 6 1.35±0.25＊ 2.33±0.52＊ 5.16±0.75＊ 9.17±0.35＊對(duì)照組 3 19.88±0.55 20.10±0.55 20.37±0.52 20.23±0.41

表4 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果比較(,度)

表4 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果比較(,度)

與對(duì)照組相比,＊P<0.05;與損傷組相比,#P<0.05。

分組 n 術(shù)后第1天 術(shù)后第3天 術(shù)后第7天 術(shù)后第14天聯(lián)合治療組 6 31.45±2.23＊# 36.58±1.52＊# 43.02±1.94＊# 48.23±2.13＊#FK506組 6 31.00±2.52＊# 36.06±2.52＊# 42.78±2.33＊# 47.83±1.93＊#損傷組 6 30.33±1.86＊ 31.50±2.43＊ 36.50±1.38＊ 40.83±1.60＊對(duì)照組 3 63.50±1.28 64.00±0.84 64.00±0.84 64.67±0.80

3 討 論

急性脊髓損傷多指脊髓遭受外力打擊后導(dǎo)致的完全性或不完全性脊髓運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、括約肌以及反射功能障礙。在脊髓休克期表現(xiàn)為損傷平面以下出現(xiàn)遲緩性癱瘓、運(yùn)動(dòng)、反射及括約肌功能喪失和大小便失禁等表現(xiàn),且預(yù)后較差[4-5]。因此,急性脊髓損傷的治療成為目前研究的熱點(diǎn)和難題。

近年來(lái)研究[6-7]發(fā)現(xiàn),局部免疫反應(yīng)引起的繼發(fā)性損傷在神經(jīng)損傷機(jī)制中起到重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道在同種異體肢體移植時(shí)常規(guī)使用FK506時(shí),發(fā)現(xiàn)移植肢體的周?chē)窠?jīng)生長(zhǎng)速度達(dá)到3～4 mm/d,可使得移植肢體提前2個(gè)月恢復(fù)肢體神經(jīng)功能[8-9]。潘峰等[3]報(bào)道在大鼠急性脊髓損傷后早期應(yīng)用低劑量FK506可減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕脊髓繼發(fā)性損傷,并促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)。楊梁等[10]報(bào)道FTY720能有效促進(jìn)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

FK506是一種廣泛應(yīng)用于器官移植術(shù)后的免疫抑制劑,可通過(guò)與其FK受體結(jié)合形成復(fù)合物而抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)的T細(xì)胞活化,阻礙T輔助細(xì)胞釋放白介素-2(IL-2)及T殺傷細(xì)胞的增殖,從而抑制細(xì)胞和體液免疫[11-12]。FK506與其結(jié)合蛋白FKBP-12形成FKBP-12復(fù)合物通過(guò)抑制損傷局部小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的聚集、活化及相關(guān)炎癥因子的釋放而減輕繼發(fā)性炎癥反應(yīng),從而對(duì)損傷局部的神經(jīng)組織起保護(hù)作用[13]。FTY720是從冬蟲(chóng)夏草中提取的一種新型免疫抑制劑,具有免疫效果強(qiáng)、毒副作用小、治療窗較寬等,還具有與其他免疫抑制劑有良好協(xié)同作用的特點(diǎn)。FTY720可顯著減少T細(xì)胞、B細(xì)胞、尤其是CD4+等淋巴細(xì)胞的數(shù)目,通過(guò)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞對(duì)趨化因子的反應(yīng)性,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢至淋巴結(jié),抑制活化的淋巴細(xì)胞對(duì)炎癥組織造成的損傷,從而保護(hù)機(jī)體組織[14]。

本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合治療組和FK506治療組大鼠斜板試驗(yàn)評(píng)分和BBB評(píng)分結(jié)果均優(yōu)于損傷組,但2者之間無(wú)顯著性差異。光鏡下可見(jiàn)損傷組術(shù)后48 h灰質(zhì)和白質(zhì)大部分壞死,而聯(lián)合治療組和FK506治療組變化明顯較輕,缺血壞死區(qū)較小,無(wú)明顯差異,提示FK506和FTY720均具有明確促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)的作用。有研究[15]表明,脊髓損傷后早期細(xì)胞凋亡是加重脊髓損傷的重要原因。本實(shí)驗(yàn)采用Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)法觀察到損傷早期即可出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞,在24 h達(dá)到高峰。損傷組和各藥物治療組在各個(gè)取材點(diǎn)的凋亡率有明顯的差異性,進(jìn)一步說(shuō)明了FK506和FTY720均具有良好的促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)的作用。

雖然目前FK506和FTY720對(duì)神經(jīng)再生的作用機(jī)制尚不是十分清楚,但是大量研究結(jié)果表明,FK506和FT Y720對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用和促進(jìn)神經(jīng)損傷功能恢復(fù)的作用是明確的,這可能與藥物通過(guò)多種機(jī)制抑制了免疫反應(yīng),從而改善了SCI傷后的局部微環(huán)境,但具體的機(jī)制、藥物劑量等尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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