Nephrin穩定血管緊張素Ⅱ誘導的足細胞細胞骨架改變的機制研究*

梁 偉， 任志龍， 韋忠平， 劉以鵬， 陳 鋮， 丁國華

(武漢大學人民醫院腎內科，湖北 武漢 430060)

1000-4718(2012)12-2216-06

2012-08-01

2012-10-17

國家自然科學基金資助項目(No.81100478；No.30900688；No.30871167)；中央高校基本科研業務費專項資金(No.111031)

△通訊作者Tel： 027-88041911-82144；E-mail: ghxding@gmail.com

Nephrin穩定血管緊張素Ⅱ誘導的足細胞細胞骨架改變的機制研究*

梁 偉， 任志龍， 韋忠平， 劉以鵬， 陳 鋮， 丁國華△

(武漢大學人民醫院腎內科，湖北 武漢 430060)

目的研究足細胞裂孔膜分子nephrin調節血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的足細胞骨架分布改變的分子機制。方法用AngⅡ及AngⅡ受體拮抗劑氯沙坦或Akt抑制劑LY294002刺激足細胞，FITC-phalloidin染色標記F-actin，分析足細胞骨架運動。Real-time RT-PCR、RT-PCR和Western blotting檢測nephrin mRNA和蛋白表達。轉染nephrin全長表達質粒(pcDNA3.1-mNPHS1)，建立穩定轉染足細胞系，Western blotting檢測轉染細胞的Akt磷酸化水平，FITC-phalloidin染色分析高表達nephrin對F-actin分布影響。結果AngⅡ和LY294002刺激后,足細胞的F-actin重組，應力纖維減少，形成F-actin外周環。氯沙坦顯著抑制F-actin重排。AngⅡ刺激后nephrin mRNA和蛋白表達顯著降低，Akt磷酸化水平降低。pcDNA3.1-mNPHS1轉染顯著上調足細胞Akt磷酸化水平，促進足細胞短線狀足突形成，部分抑制AngⅡ誘導的骨架重排。結論PI3K/Akt是nephrin和AngⅡ的共同下游通路。Nephrin能通過PI3K/Akt途徑部分穩定AngⅡ誘導的足細胞細胞骨架改變。

血管緊張素Ⅱ； 足細胞； Nephrin； 細胞骨架

足細胞即腎小球臟層上皮細胞，足突是足細胞的特殊結構，足細胞通過足突錨定于腎小球基底膜，相鄰足突分子相互交聯形成裂孔隔膜結構(slit diaphragm，SD)，是腎小球濾過膜分子屏障的重要結構基礎[1]。Nephrin是第一個被發現定位于SD的足細胞特異分子，其編碼基因NPHS1突變導致芬蘭型先天性腎病綜合征。在多種人類腎小球疾病和動物模型中存在nephrin表達和(或)分布異常，同時伴有足細胞表型改變，如足突融合[2]。腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)活性增加是慢性腎臟病進展和足細胞損傷的重要因素之一。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)作為RAS的主要效應分子，能通過血流動力學和非血流動力學多種途徑引起腎小球損傷。課題組前期研究發現AngⅡ持續輸注大鼠腎小球足細胞凋亡和足突融合，nephrin表達異常[3]。本文擬進一步用體外培養的小鼠足細胞(mouse podocyte cell line，MPC)研究nephrin在調節AngⅡ誘導足細胞骨架分布改變中的作用及機制。

材 料 和 方 法

1主要材料

胎牛血清(FBS，Gibco)，小鼠重組干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ;Protech)，AngⅡ(Sigma)，氯沙坦(Merk)，Trizol RNA提取試劑(Invitrogen)，第1鏈cDNA合成試劑盒(Toyobo)，real-time RT-PCR Master Mix和SYBR Green I(上海閃晶)，PCR Master Mix(MBI)，豚鼠抗nephrin多克隆抗體(Progen)，鼠抗β-actin單克隆抗體(Santa Cruz)，FITC-phalloidin(Sigma)，Akt抑制劑LY294002和抗p-Akt抗體(Thr308),兔抗Akt抗體(Cell Signal Technology)。小鼠nephrin全長表達質粒(pcDNA3.1-mNPHS1)由美國密歇根大學Holzman教授惠贈。

2方法

2.1細胞培養[4]小鼠永生化足細胞系由美國紐約Mount Sinai醫學院 Peter Mundel教授惠贈，本實驗室保存。在33 ℃、5% CO2培養箱中用含1×104U/L IFN-γ的培養基傳代培養，在37 ℃、5% CO2培養箱中用不含IFN-γ的培養基培養分化7～14 d用于實驗，實驗前用1%FBS低血清培養基同步化12 h。

2.2FITC-phalloidin標記足細胞F-actin細胞骨架 棄培養基，4 ℃預冷PBS輕洗，0.1% Triton X-100+2%多聚甲醛，4 ℃冰上固定30 min棄上清， PBS輕洗，FITC-phalloidin(1∶1 000，1%DMSO稀釋)，4 ℃避光孵育過夜，PBS漂洗，PI復染(2 mg/L)，室溫避光孵育15min，PBS漂洗后，抗熒光淬滅甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，攝像。肌動蛋白外周環評分(cortical F-actin score，CFS)[5]：F-actin形成正常應力纖維，0分； F-actin外周環<1/2胞膜邊緣，1分； F-actin外周環>1/2胞膜邊緣，2分； F-actin形成完整外周環，3分；每個視野計數100個細胞，取平均值。

2.3蛋白印跡 預冷PBS清洗細胞后，加入RIPA裂解液，4 ℃、12 000×g離心10 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度，20～40 μg總蛋白SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別Ⅰ抗(抗p-Akt抗體、兔抗Akt抗體、豚鼠抗nephrin多克隆抗體和鼠抗β-actin單克隆抗體)4 ℃孵育過夜， TBST清洗，加入相應的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜，ECL化學發光試劑盒顯色，X光膠片曝光、顯影、定影，凝膠成像分析系統行密度掃描。

2.4pcDNA3.1-mNPHS1質粒轉染和穩定轉染細胞株篩選 用脂質體法轉染pcDNA3.1-mNPHS1質粒，1∶10傳代后，加入合適濃度(200 mg/L)G418篩選，挑選單克隆擴增培養，獲得穩定轉染細胞株。

2.5Real-time RT-PCR和RT-PCR法檢測nephirn mRNA表達 Trizol法抽提細胞總RNA，M-MuLV逆轉錄酶逆轉錄合成第1鏈cDNA，送上海閃晶生物有限公司行real-time RT-PCR法檢測nephrin mRNA表達，nephrin上游引物5’-ATGATGCGGAGTACGAGTGC-3’，下游引物5’-GGATGAAGATGATGTCAGGTGC-3’，擴增產物片段為210 bp；β-actin上游引物5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’,下游引物5'- ATGTCACGCACGATTTCCC-3’，擴增產物片段263 bp，引物由上海閃晶生物有限公司合成。雙標準曲線法分析nephrin mRNA表達水平，用各組與對照組nephrin拷貝數比值表示nephrin相對含量。RT-PCR法檢測pcDNA3.1-mNPHS1質粒轉染后nephrin mRNA，nephrin上游引物5’-CCCAACACTGGAAGAGGTGT-3’，下游引物5’-CCCCTTGGGTCCTCATATTTT-3’，擴增產物片段為198 bp；β-actin上游引物5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’,下游引物5'-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG -3’，擴增產物片段227 bp。擴增條件為：預變性94 ℃ 3 min，94 ℃ 30s，53.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。共30個循環，延伸2 min。擴增產物瓊脂糖凝膠電泳，攝片。

3統計學處理

結 果

1AngⅡ對足細胞形態影響

正常足細胞在亞融合狀態下，細胞伸出較多足突，多呈線狀偽足,見圖1A白色箭頭所示；AngⅡ(10-8mol/L)刺激后細胞足突回縮，胞體變圓，足突呈片狀偽足,見圖1B黑色箭頭所示。

Figure 1. Podocyte morphology under inverted phase-contrast microscope(×400). A: normal podocytes; B: podocytes exposed to AngⅡ. White arrows indicate filopodia, and black arrows indicate lamellipodia.

圖1倒置相差顯微鏡下足細胞形態

2AngⅡ對足細胞F-actin分布的影響

正常足細胞F-actin聚集成束，呈微絲樣結構，沿細胞長軸分布，形成應力纖維,見圖2A，AngⅡ刺激后F-actin發生重組，排列紊亂，微絲樣結構消失，F-actin沿胞體外周分布，形成F-actin環,見圖2B～E。如圖2G所示隨著AngⅡ刺激時間延長，形成F-actin外周環細胞逐漸增多，外周環評分逐漸增高，差異有統計學意義(P<0.05)。

3氯沙坦對AngⅡ誘導足細胞F-actin重排的影響

AngⅡ受體特異性拮抗劑氯沙坦提前預處理1 h后與AngⅡ共孵育18 h，能顯著抑制F-actin重排，降低外周環評分,見圖2F、H。

4AngⅡ對足細胞nephrin表達的影響

AngⅡ刺激12 h后nephrin mRNA較對照組顯著降低，刺激24 h后nephrin mRNA約為正常對照的50%，差異有統計學意義(P<0.05),見圖3A。AngⅡ刺激6 h后nephrin蛋白水平較對照組顯著降低(P<0.05)，并呈時間依賴性降低,見圖3B。

圖2AngⅡ和氯沙坦對足細胞F-actin分布的影響

5抑制Akt活性對足細胞F-actin分布的影響

正常足細胞F-actin呈束狀沿細胞長軸分布，形成應力纖維；Akt抑制劑LY294002(50 μmol/L)孵育6 h后，部分足細胞應力纖維結構消失，F-actin排列紊亂沿細胞外周聚集，細胞偽足呈片狀,CFS指數顯著高于正常足細胞(P<0.05),見圖4。

圖3AngⅡ刺激不同時間對足細胞nephrin表達的影響

6pcDNA3.1-mNPHS質粒穩定轉染細胞株nephrinmRNA和蛋白表達

pcDNA3.1-mNPHS穩定轉染足細胞nephrin mRNA和蛋白水平較空載體轉染細胞和正常細胞顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05),見圖5。

7pcDNA3.1-mNPHS1轉染對足細胞Akt活性的影響

AngⅡ(10-8mol/L)刺激15 min后正常足細胞和空載體轉染細胞Akt磷酸化水平顯著低于同種細胞未加AngⅡ的磷酸化水平；pcDNA3.1-mNPHS1穩定轉染足細胞Akt磷酸化水平顯著高于正常足細胞和空載體轉染足細胞，AngⅡ刺激15min后Akt磷酸化水平較pcDNA3.1-mNPHS1穩定轉染細胞降低，但差異無統計學意義,見圖6。

8pcDNA3.1-mNPHS1轉染對AngⅡ誘導足細胞F-actin分布的影響

正常足細胞F-actin呈應力纖維分布；AngⅡ刺激后F-actin沿胞體外周分布；pcDNA3.1-mNPHS1穩定轉染足細胞F-actin同樣呈應力纖維樣分布，部分細胞沿胞膜伸出短線狀偽足；pcDNA3.1-mNPHS1穩定轉染足細胞并用AngⅡ(10-8mol/L)刺激18 h后，F-actin束狀應力纖維結構減少，F-actin沿胞膜外周分布，部分細胞仍伸出短線狀偽足結構,但CFS較未轉染質粒的AngⅡ刺激細胞顯著降低,見圖7。

圖4Akt抑制劑LY294002對足細胞骨架的影響

討 論

AngⅡ作為RAS的主要效應分子，能通過血流動力學和非血流動力學多種途徑引起腎小球損傷。課題組前期研究發現,AngⅡ持續輸注大鼠腎小球足細胞凋亡和足突融合[3]，用永生化小鼠足細胞系研究發現AngⅡ以濃度和時間依賴方式誘導小鼠足細胞凋亡，SD特異分子nephrin可通過PI3K/Akt途徑抑制AngⅡ誘導的小鼠足細胞凋亡[6]。本文研究nephrin在調節AngⅡ誘導足細胞骨架分布改變中的作用，進一步探討足細胞足突融合及調節機制。

以足細胞損傷或功能異常為起始的腎小球疾病稱為足細胞病(podocytopathy)，多種原發(如微小病變、局灶節段硬化和膜性腎病)和繼發(如糖尿病腎病、HIV相關腎病、狼瘡性腎炎等)性腎小球疾病均存在不同程度足細胞損傷和表型改變，而足突融合見于多種腎小球疾病[7-9]。足突融合是足細胞損傷的特征性表型改變，足突的細胞骨架是由短枝狀F-actin和細胞骨架相關蛋白相互交聯形成的環狀微絲束[10-11]。本研究發現正常足細胞F-actin主要形成應力纖維，AngⅡ刺激后F-actin排列紊亂向細胞外周邊集，形成F-actin外周環，CFS隨刺激時間延長逐漸增加，AngⅡ誘導的骨架重排被AngⅡ受體拮抗劑氯沙坦抑制。倒置相差顯微鏡下還觀察到AngⅡ刺激后足細胞偽足由長絲狀偽足轉變為短片狀偽足，細胞形態發生明顯改變。因此，AngⅡ可以誘導F-actin重排使足細胞足突和細胞形態發生改變，是足突融合重要的損傷因素。

圖5pcDNA3.1-mNPHS質粒轉染對足細胞nephrinmRNA和蛋白表達的影響

圖6pcDNA3.1-mNPHS質粒轉染對足細胞磷酸化Akt影響

圖7pcDNA3.1-mNPHS1轉染對AngⅡ誘導足細胞骨架重排的影響

Nephrin是首先發現的定位于裂孔膜的足細胞特異分子，屬免疫球蛋白超家族成員，分為胞外段、跨膜段和胞內段。相鄰足突nephrin或其它裂孔膜蛋白胞外段相互交聯形成裂孔膜結構，胞內段含多個酪氨酸殘基，酪氨酸殘基磷酸化后，與含SH2、SH3結構的結合蛋白(主要包括podocin、CD2AP和Nck)的親和力顯著增加，參與多種細胞信號轉導[2]。Huber等[12]研究表明，在HEK293T細胞中PI3K的P85調節亞單位可以分別和CD2AP、nephrin發生免疫共沉淀。Nephrin轉染能通過活化PI3K-Akt，明顯抑制犬腎細胞(Madin-Daby canine kidney cells，MDCK)和條件永生性足細胞由脫離基質而誘導的細胞凋亡。新近研究發現，磷酸化nephrin能通過與適配蛋白Nck結合，調節肌動蛋白微絲重組[13-14]。

PI3K/Akt通路的下游信號除參與調節細胞增殖和凋亡外，近年研究發現還與細胞骨架組裝有關。Somanath等[15]在內皮細胞和成纖維細胞中發現Rac1(小G蛋白磷酸酶)是Akt的下游信號分子，參與調節細胞骨架重組。本研究用Akt抑制劑LY294002可誘導肌動蛋白骨架重組，推測PI3K/Akt也可能通過Rac1信號通路參與足細胞肌動蛋白骨架重組。pcDNA3.1-mNPHS1質粒轉染后可上調Akt磷酸化水平，因此PI3K/Akt可能是nephrin的下游信號通路影響細胞骨架重排。Zhu等[16]報道nephrin可直接通過PI3K/Akt/Rac1信號通路影響肌動蛋白重排。本研究還發現pcDNA3.1-mNPHS1轉染能促進足細胞應力纖維和線狀偽足形成，但不能完全阻止AngⅡ誘導的細胞骨架重排。因此，nephrin和AngⅡ可共同通過PI3K/Akt信號通路影響足細胞肌動蛋白骨架重排，但除PI3K/Akt外，AngⅡ還可能通過非nephrin依賴的信號轉導影響肌動蛋白骨架重排，仍有待進一步研究。

綜上所述，PI3K/Akt是nephrin和AngⅡ的共同下游通路。Nephrin能通過PI3K/Akt途徑部分穩定AngⅡ誘導足細胞細胞骨架改變。這些結果對明確足突融合分子機制有一定的意義。

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RoleofnephrininpreventingangiotensinⅡ-inducedcytoskeletalrearrangementinglomerularpodocytes

LIANG Wei, REN Zhi-long, WEI Zhong-ping, LIU Yi-peng, CHEN Cheng, DING Guo-hua

(DivisionofNephrology,People’sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China.E-mail:ghxding@gmail.com)

AIM: To investigate the role of nephrin, a slit diaphragm-associated protein, in angiotensinⅡ (AngⅡ)-induced cytoskeleton rearrangement in podocytes.METHODSImmortalized mouse podocytes were exposed to AngⅡ (10-8mol/L) with or without AngⅡ receptor antagonist lorsatan and Akt inhibitor LY294002. FITC-conjugated phalloidin was used to stain F-actin, and semi-quantitative system with cortical F-actin score (CFS) was introduced to analyze the degree of actin cytoskeleton arrangement. The expression of nephrin was assessed by quantitative real-time RT-PCR,RT-PCR and Western blotting. Undifferentiated podocytes were transfected with pcDNA3.1-mNPHS1 plasmid containing the full length of nephrin. The stably transfected cell line was generated by G418 selection. Phosphorylation level of Akt was assessed by Western blotting, and F-actin distribution was further evaluated in transfected cells exposed to AngⅡ or not.RESULTSCytoskeletal rearrangements including cortical F-actin ring formation and stress fiber attenuation were observed in Ang II-and LY294002-stimulated podocytes. Pretreatment with losartan significantly prevented Ang II-induced actin cytoskeleton reorganization. The mRNA and protein levels of nephrin and phosphorylation of Akt were obviously decreased in the podocytes exposed to Ang II, which were dramatically reversed by pcDNA3.1-mNPHS1 transfection. Transfection of pcDNA3.1- mNPHS1 induced the formation of short filopodia and partially prevented AngⅡ-induced F-actin remodeling.CONCLUSIONPI3K/Akt signaling is a common downstream pathway of nephrin and Ang Ⅱ. Nephrin is able to stabilize AngⅡ-induced cytoskeletal rearrangement via PI3K/Akt signaling pathway.

Angiotensin II; Podocytes; Nephrin; Cytoskeleton

R34

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.12.019