野黃苓甙在體外肝臟灌流復(fù)蘇大鼠無(wú)心跳邊緣供肝中的作用*

龔 瑾， 蘭 薇， 龍 剛， 王西墨， 杜 江， 黃志宇， 陳建帆， 陳 實(shí)

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科，廣東 廣州 510632；2廣東省第二人民醫(yī)院移植科，廣東 廣州 510317；3天津市人民醫(yī)院外科， 天津 300120；4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所，湖北 武漢 430030)

1000-4718(2012)05-0951-05

2011-11-07

2012-03-27

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2003AA205009)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.A2009356)；廣東省中醫(yī)藥局科研基金資助項(xiàng)目(No.2009175)；廣州市科技計(jì)劃(No.2011J4100078)

△通訊作者 Tel: 020-38688613; E-mail: gongjin622@yahoo.com.cn

野黃苓甙在體外肝臟灌流復(fù)蘇大鼠無(wú)心跳邊緣供肝中的作用*

龔 瑾△1， 蘭 薇2， 龍 剛3， 王西墨3， 杜 江1， 黃志宇1， 陳建帆1， 陳 實(shí)4

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科，廣東 廣州 510632；2廣東省第二人民醫(yī)院移植科，廣東 廣州 510317；3天津市人民醫(yī)院外科， 天津 300120；4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所，湖北 武漢 430030)

目的探討野黃苓甙在大鼠體外肝臟灌流復(fù)蘇無(wú)心跳邊緣供肝過程中對(duì)供肝功能和超微結(jié)構(gòu)的影響。方法采用清潔級(jí)雄性Wistar大鼠24只，無(wú)心跳供肝按熱缺血時(shí)間和處理方法的不同隨機(jī)分為3組。A組(n=8)無(wú)心跳供肝的熱缺血時(shí)間在安全時(shí)限內(nèi)(15～20 min)，B組(n=8)和C組(n=8)無(wú)心跳供肝的熱缺血時(shí)間均為45 min；3組均采用體外肝臟灌流系統(tǒng)(ECLP)常溫灌流6 h，其中C組在灌流液中定時(shí)加入定量的野黃芩甙溶液。觀察灌流后1 h、3 h和6 h供肝膽汁分泌量的變化以及灌流液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和內(nèi)皮素-1(ET-1)水平的變化；在灌流前和灌流后1 h、3 h和6 h分別取3組供肝標(biāo)本，通過透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果B、C 2組供肝在灌流后1 h和3 h膽汁分泌量與A組相比差異顯著(P<0.05)，但隨著灌流時(shí)間的延長(zhǎng)，在灌流后6 h 3組差異不顯著(P>0.05)，灌流后3 h B和C組差異顯著(P<0.05)。灌流液中ALT 和ET-1的水平在3個(gè)時(shí)點(diǎn)B組、C組與A組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組和C組在灌流后3 h和6 h差異顯著(P<0.05)，但在灌流后1 h差異不顯著(P>0.05)。超微病理變化顯示灌注前與A組相比，B、C 2組供肝的肝細(xì)胞線粒體部分膜斷裂，嵴疏松溶解,核皺縮變形，染色質(zhì)粗糙，核仁濃縮甚至裂解。灌流3 h后B、C 2組供肝的超微結(jié)構(gòu)均有明顯的恢復(fù)，灌流6 h后C組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)得更加明顯。結(jié)論體外肝臟灌流野黃苓甙能夠改善無(wú)心跳邊緣供肝的功能和超微結(jié)構(gòu)。

野黃苓甙； 體外肝臟灌流； 無(wú)心跳邊緣供肝； 復(fù)蘇

無(wú)心跳供肝(non-heart-beating donor livers，NHBD livers) 的利用是解決臨床肝移植中供肝短缺的一個(gè)重要途徑。經(jīng)歷超過安全時(shí)限的熱缺血損傷的肝臟被稱為邊緣供肝，其再經(jīng)低溫保存后進(jìn)行移植容易導(dǎo)致原發(fā)性移植物無(wú)功能[1]。野黃苓甙是從天然植物燈盞花中提取的黃酮類活性成分,研究表明其能改善組織缺血后的細(xì)胞水腫、凋亡、壞死等病理改變,降低細(xì)胞內(nèi)多種酶的釋放、鈣內(nèi)流、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、氧自由基水平等[2-3]。本研究將利用自行構(gòu)建的模擬生理的肝臟體外灌流(extracorporeal liver perfusion，ECLP)系統(tǒng)處理無(wú)心跳邊緣供肝，觀察供肝功能“復(fù)蘇”的可能性以及野黃苓甙預(yù)處理對(duì)供肝功能和超微結(jié)構(gòu)的影響，為無(wú)心跳邊緣供肝的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物所。

1.2器材和藥品 蠕動(dòng)泵(型號(hào): BT01-YZ1515,北京信康億達(dá)科技發(fā)展有限公司);熱交換器(heat exchanger;Medtro-nic);中空纖維膜式氧合器(hollow fiber oxygenater;Medtronic); 數(shù)顯控溫水溫箱(型號(hào): GKX21Cr,上海錦屏儀器儀表有限公司)。灌流液為Krebs-Henseleit溶液，其中加入50%葡萄糖溶液和ATP。野黃苓甙從燈盞花粉劑中分離，提純獲得后制成溶液備用，其化合物結(jié)構(gòu)均經(jīng)化學(xué)和光譜方法鑒定確認(rèn)，由南開大學(xué)化學(xué)元素研究所提供。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組 24只大鼠隨機(jī)分為3組,每組8只：(1)A組(對(duì)照組)：供肝熱缺血時(shí)間在安全時(shí)限(15～20 min)內(nèi)；(2)B組：供肝熱缺血時(shí)間為45 min；(3)C組：供肝熱缺血時(shí)間為45 min。3組供肝切取后連接ECLP系統(tǒng)灌流6 h，其中C組在灌流液中每小時(shí)加入野黃苓甙溶液1 mL(含野黃苓甙100 μg)。

2.2灌流系統(tǒng) 參考我們以往設(shè)計(jì)的豬肝臟灌流系統(tǒng)，在管路和流量控制上做了改進(jìn)和優(yōu)化[4]。在參照大鼠生理參數(shù)的基礎(chǔ)上仍采用同時(shí)灌流門靜脈和肝動(dòng)脈，但分別氧合其入肝血流的方式模擬大鼠的體內(nèi)生理環(huán)境。圖1為大鼠體外肝臟灌流系統(tǒng)連接示意圖。

Figure 1. Hepatic circuit for extracorporeal liver perfusion.

圖1肝臟體外灌流循環(huán)連接示意圖

2.3供肝獲取 供體大鼠采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液40 mg·kg-1麻醉，仰臥位固定后行腹正中切口。經(jīng)陰莖背靜脈注入肝素鈉生理鹽水2 mL(含肝素鈉500 U)，約5 min后開胸用血管鉗夾閉心臟基底部致心臟停搏，熱缺血時(shí)間自?shī)A閉心臟基底部起至體外灌流前測(cè)算。游離肝臟，分離門靜脈，肝動(dòng)脈和肝上下腔靜脈后插管并用肝素鹽水灌洗后結(jié)扎并切斷肝下下腔靜脈準(zhǔn)備連接灌流系統(tǒng)。膽管插入硬膜外麻醉導(dǎo)管以方便測(cè)量膽汁的分泌量。

2.4觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法 (1)記錄各組肝臟的熱缺血時(shí)間，用特制的帶刻度的小試管測(cè)量灌流后1 h、3 h和6 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)的膽汁分泌量。(2)檢測(cè)再灌流后1 h、3 h和6 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)灌流液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)的水平。(3)3組供肝分別在切取后和灌流1 h、3 h和6 h取材。每次取小塊新鮮肝左外葉組織后放在2.5% 戊二醛磷酸緩沖固定液中切成1 mm×1 mm×1 mm大小進(jìn)行預(yù)固定，并隨機(jī)取4～5塊放回固定液中繼續(xù)固定； 用蔗糖沖洗液沖洗1～2 h，共3次，過夜；用1%四氧化鋨酸緩沖液沖洗后固定1～2 h；用50%、70%、80%、90%乙醇以及無(wú)水乙醇各脫水10～15 min。環(huán)氧樹脂包埋后切片并染色，在透射電鏡下觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1各組供肝灌流期膽汁的分泌量

3組供肝的膽汁分泌量均隨灌流時(shí)間有升高的趨勢(shì)，在1 h和3 h 時(shí)點(diǎn)B組和C組與A組相比差異顯著(P<0.05),但在6 h時(shí)點(diǎn)3組相比差異無(wú)顯著(P>0.05)。B組和C組在1 h時(shí)點(diǎn)差異無(wú)顯著(P>0.05)，但在3 h時(shí)點(diǎn)差異顯著(P<0.05)，見表1。

表1各組供肝灌流期膽汁分泌量的變化

Group1h3h6hA0.48±0.150.53±0.120.56±0.18B0.28±0.24△0.47±0.19△0.53±0.21C0.29±0.20△0.51±0.22△#0.55±0.16

△P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup B.

2各組灌流液中ALT水平的變化

3組灌流液中ALT水平均隨灌流時(shí)間延長(zhǎng)有升高的趨勢(shì)，在1 h、3 h 和6 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)B、C組與A組相比差異均顯著(P<0.05)。B組和C組在1 h時(shí)點(diǎn)差異無(wú)顯著(P>0.05)，但在3 h和6 h時(shí)點(diǎn)差異顯著(P<0.05)，見表2。

表2各組灌流液中ALT水平的變化

Group1h3h6hA266.50±11.38412.73±20.82629.14±18.10B487.26±27.62△632.50±21.24△882.35±31.48△C492.47±22.59△596.42±27.28△#748.73±22.36△#

△P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup B.

3各組灌流液中ET-1水平的變化

3組灌流液中ET-1水平均隨灌流時(shí)間延長(zhǎng)有升高的趨勢(shì)，在1 h、3 h和6 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)B、C組與A組相比差異均顯著(P<0.05)。B組和C組在1 h時(shí)點(diǎn)差異無(wú)顯著(P>0.05)，但在3 h和6 h時(shí)點(diǎn)差異顯著(P<0.05),見表3。

表3各組灌流液中ET-1水平的變化

Group1h3h6hA116.46±12.27134.38±18.19142.64±22.15B135.72±24.64△152.62±19.71△168.76±25.21△C136.68±19.52△143.86±20.16△#157.43±23.76△#

△P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup B.

4肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

A組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見明顯變化，細(xì)胞間隙稍大，線粒體膜尚清晰。B組和C組在灌流前肝細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重濃縮，細(xì)胞間隙明顯增寬。細(xì)胞核嚴(yán)重皺縮變形，染色質(zhì)粗燥。核仁濃縮甚至部分裂解。線粒體嚴(yán)重腫脹，膜發(fā)生部分?jǐn)嗔?，部分嵴疏松溶解，見圖2。和灌流前相比，隨著灌流時(shí)間的延長(zhǎng)2組線粒體的水腫逐漸減輕，細(xì)胞間隙變窄，細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，灌流后6 h時(shí)恢復(fù)更明顯，C組比B組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改善更為明顯，見圖3。

討 論

超過安全時(shí)限的無(wú)心跳供肝由于遭受了較長(zhǎng)時(shí)間的熱缺血損傷,并且在移植過程中不可避免地面臨后續(xù)的冷保存及再灌注損傷,這些都成為導(dǎo)致原發(fā)性移植肝無(wú)功能的主要原因而被棄用[5-6]。肝臟缺血再灌注損傷的原因較多，有氧自由基、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子等導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷引發(fā)微循環(huán)障礙，但確切機(jī)制仍不清楚。最近的研究表明[7-9]：在肝臟缺血損傷早期，肝細(xì)胞的損傷大多處于可復(fù)性階段，通過恢復(fù)氧氣和能量的供應(yīng)，可以改善肝細(xì)胞的有氧代謝，并使某些可逆性損傷得以恢復(fù)。

Figure 2. The ultrastructures of hepatocytes before perfusion(×10 000). A: group A; B: group B; C: group C.

圖2灌流前3組供肝的超微結(jié)構(gòu)

Figure 3. The ultrastructures of hepatocytes after 6 h of perfusion.A: group A (×3 000); B:group B (×7 000); C: group C (×10 000).

圖3灌流后6h3組供肝的超微結(jié)構(gòu)

本課題小組在前期研究已證明利用自行構(gòu)建的模擬生理的體外肝臟灌流系統(tǒng)為離體肝臟提供ATP及其前提物質(zhì)和氧氣，能夠抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的損傷以及繼發(fā)于內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起的微循環(huán)障礙[10-11]。野黃苓甙是從中草藥燈盞花中分離提取的黃酮類化合物，具有抗凝、擴(kuò)血管和減輕氧自由基損傷等作用[12-14]，已在心腦血管疾病中廣為應(yīng)用，但在無(wú)心跳供肝I/R損傷的防護(hù)中研究很少。它是在黃芩素的4位接上1個(gè)羥基,從而對(duì)蛋白激酶C(protein kinase C,PKC) 有很好的抑制作用[15-16]。PKC 可廣泛傳遞各種細(xì)胞外信息通過細(xì)胞膜,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)許多依賴Ca2+的代謝過程，在缺血/ 再灌流這一病理生理過程中,胞漿中的PKC 移位到細(xì)胞膜而被激活,激活的PKC 可以通過加重細(xì)胞內(nèi)鈣超載、引起血管收縮、降解細(xì)胞骨架成分等途徑引起缺血性損傷[17-18]。野黃苓甙已被證明是一種PKC的抑制劑，它能夠有效地抑制肝組織PKC的活性從而來減輕肝細(xì)胞的損傷，這種抑制并非作用于酶的活性中心，而是通過非競(jìng)爭(zhēng)抑制來完成[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)野黃苓甙在ECLP系統(tǒng)“復(fù)蘇”邊緣供肝中能夠進(jìn)一步改善供肝的功能和肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷的恢復(fù)：膽汁的形成經(jīng)過了極其復(fù)雜的肝臟細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化和膽道系統(tǒng)的排泌過程，因此膽汁分泌和引流的情況是衡量和觀察供肝功能狀態(tài)的準(zhǔn)確和靈敏的的指標(biāo)[21]。本實(shí)驗(yàn)中3組供肝在再灌流初期的膽汁分泌量較少，隨著灌流時(shí)間的延長(zhǎng)而有所增長(zhǎng)。這可能與在再灌流后得到維持功能的氧氣和能量后一些可逆性損傷得以恢復(fù)，肝臟的生理功能也逐漸改善。在肝細(xì)胞或線粒體膜損傷時(shí)會(huì)引起灌流液中許多有關(guān)肝臟酶學(xué)和反應(yīng)微循環(huán)狀況的細(xì)胞因子的變化，本實(shí)驗(yàn)中各組灌流液中ALT 和ET-1水平的變化反映了肝功能的狀態(tài)和微循環(huán)的改善。電鏡下發(fā)現(xiàn)scutellarein+ECLP預(yù)處理能夠明顯促進(jìn)邊緣供肝超微結(jié)構(gòu)損傷的恢復(fù)，并能在一定程度上逆轉(zhuǎn)線粒體的損傷，這與文獻(xiàn)報(bào)道和我們前期的研究結(jié)果是相符的。

本實(shí)驗(yàn)研究表明模擬生理的體外肝臟灌流系統(tǒng)能夠“復(fù)蘇”超過安全時(shí)限一定時(shí)間的的無(wú)心跳邊緣供肝，同時(shí)利用野黃苓甙預(yù)處理能夠進(jìn)一步改善這一病理生理過程中肝細(xì)胞功能和超微結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，但其詳細(xì)機(jī)制還有待于進(jìn)一步闡明。

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EffectofscutellarinonresuscitatingratNHBMDliverswithextracorporealliverperfusioninvitro

GONG Jin1, LAN Wei2, LONG Gang3, WANG Xi-mo3, DU Jiang1, HUANG Zhi-yu1, CHEN Jian-fan1, CHEN Shi4

(1DepartmentofSurgery,theFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofOrganTransplantation,GuangdongNo.2ProvincialPeople’sHospital,Guangzhou510317,China;3DepartmentofSurgery,TianjinPeople’sHospital,Tianjin300120,China;4InstituteofOrganTransplantation,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:gongjin622@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effect of scutellarin on resuscitating rat non-heart-beating marginal donor (NHBMD) livers with extracorporeal liver perfusioninvitro.METHODSTwenty-four male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: group A (n=8), the livers were subject to 15～20 min of warm ischemia; group B (n=8) and group C (n=8), the livers were subject to 45 min of warm ischemia. All the livers were treated by extracorporeal liver perfusion (ECLP), and scutellarin solution was add to the perfusion fluid in group C with the intervals of 1 h. The data of bile production and the markers of hepatocyte reperfusion injury of the livers,alanine aminotransferase (ALT) and endothelin-1 (ET-1), in each group were tested. The liver tissues in each group were obtained before perfusion and 1 h, 3 h and 6 h after perfusion, and then observed under transmission electron microscope to investigate the changes of ultrastructures.RESULTSWith the time of perfusion went on, the livers in group B and group C demonstrated recovery of synthe-tic function after 3 h and 6 h of perfusion, and the production of bile in group B and group C was not significantly different from that in group A after 6 h of perfusion (P>0.05). The levels of ALT and ET-1 in group B and group C were significantly higher than those in group A after 1 h, 3 h and 6 h of perfusion (P<0.05), and those in group C was significantly lower than those in group B after 3 h and 6 h of perfusion (P<0.05). The ultrastructural destruction of the liver cells in both group B and group C was more serious than that in group A. After 3 h and 6 h of perfusion, the destruction of the liver cells was partly recovered, and the recovery degree in group C was more obvious than that in group B.CONCLUSIONScutellarin may play a significant role in resuscitating rat NHBMD livers with extracorporeal liver perfusioninvitro.

Scutellarin; Extracorporeal liver perfusion; Non-heart-beating marginal donor livers; Resuscitation

R329.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.035