慢性心理應激對大鼠實驗性牙周炎及血清乳酸脫氫酶1的影響*

黃世光， 王曉歌， 潘倩茹， 黃 博， 呂芳麗, 葉秀華， 楊云珍， 郭柳婷， 練楚文

(1暨南大學醫學院口腔醫學系, 廣東 廣州 510632；2中山大學醫學院寄生蟲學教研室，廣東 廣州 510080)

1000-4718(2012)05-0924-05

2011-12-20

2012-03-08

國家自然科學基金資助項目 (No.81071387)；暨南大學優秀本科推免生科研創新培育計劃；暨南大學本科生科技創新工程項目(No.CX11139)

△通訊作者Tel：020-85221165；E-mail：thshg@126.com

慢性心理應激對大鼠實驗性牙周炎及血清乳酸脫氫酶1的影響*

黃世光1△， 王曉歌1， 潘倩茹1， 黃 博2， 呂芳麗2, 葉秀華1， 楊云珍1， 郭柳婷1， 練楚文1

(1暨南大學醫學院口腔醫學系, 廣東 廣州 510632；2中山大學醫學院寄生蟲學教研室，廣東 廣州 510080)

目的通過建立大鼠實驗性牙周炎模型，探討慢性心理應激影響牙周炎的致病機制。方法清潔級4 周齡雌性Wistar大鼠80只，隨機分為4組：(1)正常對照組；(2)實驗性牙周炎組：用浸有牙周致病菌的絲線結扎左側上頜第二磨牙牙頸部復制牙周炎模型；(3)單純應激組：牙周不作特殊處理，給予應激刺激；(4)牙周炎+應激組：按上法復制牙周炎模型，并予以應激刺激。各組動物分別于實驗后第2、4、6和8 周分批處死，各時點每組處死動物5只。大鼠處死前尾靜脈采血檢測血糖濃度、心臟采血檢測血清促腎上腺皮質激素(ACTH)、乳酸脫氫酶(LDH)及其同工酶LDH1。制作組織切片，HE染色觀察大鼠左側上頜第二磨牙牙周組織的炎性變化及牙槽骨的吸收情況。結果(1)單純應激組及牙周炎+應激組血糖及血清ACTH水平在2和4 周時明顯高于正常對照組和實驗性牙周炎組(P<0.01)，牙周炎+應激組在6和8周時血糖及血清ACTH水平仍較正常對照組和實驗性牙周炎組高(P<0.01)；(2)牙周炎+應激組血清LDH水平在各時點明顯高于正常對照組和實驗性牙周炎組(P<0.01)，牙周炎+應激組血清LDH1水平在各時點均明顯低于正常對照組和實驗性牙周炎組(P<0.01)；(3)組織學觀察顯示與正常對照組和單純應激組牙齦及牙槽骨均無明顯改變；牙周炎+應激組牙齦組織的炎癥及牙槽骨破壞程度在4、6和8周時明顯高于牙周炎組。結論應激刺激可能通過降低牙周組織氧代謝水平加重大鼠牙周炎癥程度。

牙周炎； 模型，動物； 心理應激； 乳酸脫氫酶

研究表明心理應激是影響牙周病發生、發展和預后的重要因素之一[1]，心理應激影響牙周炎的確切機制至今尚未闡明。牙周組織氧代謝對炎癥發展可能有重要影響，而心理應激可能通過影響牙周組織氧代謝而在牙周炎的發生和發展中發揮作用。我們前期的研究顯示牙周炎形成過程與組織氧代謝水平下降密切相關[2-3]，牙周炎時牙周組織的腫脹及牙周袋的形成可導致牙周組織處于乏氧狀態。

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是細胞能量代謝中的重要催化酶，參與糖酵解，并能催化丙酮酸還原后生成乳酸，完成葡萄糖無氧酵解的過程，同時釋放少量ATP為缺氧狀態下的生命活動提供能量。乳酸脫氫酶有LDH1～5共5個同工酶，在發生病變時LDH同工酶譜也發生變化[4]。根據LDH及其同工酶分布特點，通過檢測血清乳酸脫氫酶及其同工酶活性的變化可判斷組織的氧代謝狀況。本文通過建立大鼠實驗性牙周炎模型，觀察慢性心理應激對牙周炎及牙周組織的影響，同時檢測大鼠血清LDH及其同工酶LDH1的水平，以了解慢性心理應激對牙周炎及其氧代謝的影響情況。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 清潔級雌性4周齡SD大鼠80只，體重約150 g，由中山大學醫學院實驗動物中心提供。

1.2試劑 促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)試劑盒購自Siemens Healthcare Diagnostic Inc.；乳酸脫氫酶測定試劑盒購自四川邁克生物科技股份有限公司；LDH1測定試劑盒購自北京利德曼生化股份有限公司；拜安易血糖檢測試紙購自拜耳醫藥保健有限公司。

2方法

2.1動物模型的制備 用隨機數字表法將動物分成4組，每組20只：(1)正常對照組(control group)：牙周不做任何處理；(2)實驗性牙周炎組(experimental periodontitis group)：參照Huang等[3]的方法，用浸有牙周致病菌的3/0絲線結扎左側上頜第二磨牙頸部(圖1)復制牙周炎模型; (3)單純應激組(stress group)：牙周不做結扎處理，每天施以應激刺激；(4)牙周炎+應激組(periodontitis + stress group)：按上法復制牙周炎模型，并于術后第0 d起每天施以應激刺激。各組動物分別于實驗后2、4、6和8周分批處死，各時點每組處死動物5只。

Figure 1. A standard ligature picture showed wrapped silk.

圖13/0絲線結扎上頜第二磨牙頸部

2.2應激方案 單純應激組與牙周炎+應激組采用4種應激方案：(1)沖水應激：將大鼠置于空間局限的小鐵籠中，將自來水管水量調至最大，連續沖擊大鼠2 h，期間不斷轉動鐵籠以改變水流沖擊方向；(2)泡水應激：將大鼠置于空間局限的小鐵籠中，并用水浸至大鼠鎖骨以上位置，浸泡2 h；(3)冰水混合物浸泡應激：將大鼠置于空間局限的小鐵籠中，并在籠中加入可浸沒大鼠腿部的冰水混合物，浸泡2 h；(4)驅鼠器應激：將大鼠置于單獨房間，開啟電子驅鼠器24 h。每天隨機選擇4種應激方法中的1種方法對以上2組大鼠施以應激。

2.3血糖、ACTH、LDH及LDH1的測定 大鼠處死前在非麻醉狀態下剪尾取尾靜脈血，采用拜安易血糖儀及血糖試紙測定血糖值。2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后固定大鼠，心臟采血2 mL，室溫下于肝素抗凝管靜置1 h ，-25 ℃冰箱過夜，4 000 r/min離心10 min，取血清用以測定LDH、LDH1和ACTH。運用IFCC法測定LDH：R1與R2液按4∶1混合，混勻，37 ℃恒溫1 min，以空白管調零，測定各管初始吸光度，然后計算吸光度變化值ΔA/min，校準。運用乳酸基質速率法測定LDH1：S+R1液在37 ℃保溫60 s后加入R2試劑，保溫90 s后測量2 min內的吸光度變化，校準。采用化學發光法測定ACTH，按試劑盒說明書操作。

2.4組織學觀察 采用10%中性甲醛溶液心臟灌注處死大鼠，取上頜骨標本于10%中性甲醛溶液中固定48 h以上。剝離左側上頜第二磨牙頰、腭側牙齦，制成頰腭向5 μm厚度的牙齦組織切片，HE染色。頜骨標本采用混合脫鈣液脫鈣，制成近遠中向5 μm厚度的牙體牙周組織聯合切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察牙周組織及牙槽骨的組織學改變。

3統計學處理

結 果

1應激標記物的實驗室檢測

血糖水平改變見表1，結果顯示心理應激組及牙周炎+應激組血糖在2和4 周時明顯高于正常對照組和牙周炎組(P<0.01)；心理應激組在6和8周時血糖恢復正常水平(P>0.05)，但牙周炎+應激組血糖水平仍較正常對照組(P<0.01)和牙周炎組高(P<0.01)。

表1各實驗組和對照組大鼠血糖水平的變化

Group2weeks4weeks6weeks8weeksControl5.9±1.25.8±1.36.0±1.25.9±1.5Periodontitis5.7±1.55.9±1.45.9±1.45.7±1.6Stress8.3±1.1▲▲8.1±1.2▲▲6.3±1.56.1±1.3Periodontitis+stress8.6±1.3▲▲8.0±1.4▲▲8.2±1.4▲▲8.9±1.7▲▲

▲▲P<0.01vscontrol or periodontitis group.

血清ACTH水平改變見表2，結果顯示心理應激組及血清ACTH在2和4 周時明顯高于正常對照組和牙周炎組(P<0.01)，在6和8周時血清ACTH有所下降，但仍高于正常對照組和牙周炎組(P<0.05)；牙周炎+應激組血清ACTH在各時點均顯著高于正常對照組和牙周炎組(P<0.01)。

表2 各實驗組和對照組大鼠血清ACTH水平的變化

▲P<0.05,▲▲P<0.01vscontrol or periodontitis group.

血清LDH水平改變見表3，結果表明牙周炎+應激組血清LDH在各時點明顯高于正常對照組和牙周炎組(P<0.01)；單純應激組除了在2周時明顯高于正常對照組和牙周炎組(P<0.01)外，在4、6、和8周時血清LDH水平與正常對照組和牙周炎組相比無顯著差異(P>0.05)。

表3 各實驗組和對照組大鼠血清LDH水平的變化

▲▲P<0.01vscontrol or periodontitis group.

血清LDH1水平改變見表4，結果顯示牙周炎+應激組血清LDH1在各時點均明顯低于正常對照組和牙周炎組(P<0.01)，單純應激組除了在2周時明顯低于正常對照組和牙周炎組(P<0.01)外，在4、6、和8周時血清LDH1水平與正常對照組和牙周炎組相比無顯著差異(P>0.05)。

表4 各實驗組和對照組大鼠血清LDH1水平的變化

▲▲P<0.01vscontrol or periodontitis group.

2組織學改變

正常對照組：牙齦上皮結構完整，結合上皮附著于釉-牙骨質界附近,牙周膜纖維排列整齊，結締組織內未見明顯的炎癥細胞浸潤，固有牙槽骨形態結構完整，見圖2A、B。實驗性牙周炎組：牙齦上皮見潰瘍，結合上皮向根方增殖，組織深部可見大量炎癥細胞浸潤，血管擴張充血，膠原纖維變性，牙槽骨表面可見活躍的破骨細胞和骨吸收，呈凹坑狀吸收，牙槽嵴頂高度降低，見圖2C、D。單純應激組:牙周組織結構正常，溝內上皮、結合上皮完整，牙周膜纖維排列整齊，牙槽骨未見吸收，見圖2E、F。牙周炎+應激組：牙周膜纖維出現膠原疏松、變性，炎癥細胞浸潤明顯，纖維排列紊亂，牙槽嵴頂有破壞吸收，可見破骨細胞和骨吸收陷窩，見圖2G、H。

Figure 2. Histological changes of alveolar bone(A,C,E,G;HE staining,×50)and periodontal tissues(B,D,F,H;HE staining,× 100).A,B:control group, no inflammation was found in periodontal tissues；C,D: experimental periodontitis group(4 weeks), moderate inflammation was present；E,F: stress group(6 weeks), no inflammation was found in periodontal tissues；G,H: periodontitis + stress group(8 weeks), severe inflammation was present.

圖2各組牙槽骨組織及牙周組織的HE染色結果

討 論

牙周疾病的發病機制極其復雜，菌斑微生物是牙周病的始動因素，但單純的細菌因素不足以解釋疾病的復雜性和嚴重性。研究表明心理應激是影響牙周病發生、發展和預后的重要因素之一[5]。在應激影響牙周病的發病機制方面，一些學者認為多種緊張刺激或一種持久反復的緊張刺激可造成免疫防御能力降低，增加機體對致病菌的易感性，從而加重牙周病變。心理應激還可通過刺激交感-腎上腺髓質軸，引起血漿中腎上腺素和去甲腎上腺素濃度升高，參與調控機體對應激的急性反應；同時心理應激介導一系列的代謝和心血管代償機制如調節心律和外周血管阻力、抑制胰島素分泌、刺激胰高血糖素的分泌等，導致外周微血管收縮，微循環血液流量減少，從而導致牙周組織處于乏氧狀態。

幾個相關的研究報道心理壓力和牙齦炎癥呈正相關[6-7]。Moss等[8]的研究表明社會心理壓力是導致大面積牙槽骨喪失的重要原因。心理應激動物模型常采用束縛應激[9]、強迫游泳[10]、抑郁[11]和孤養[12]等。本實驗采用沖水、泡水、冰水混合物浸泡和驅鼠器4種應激方法，每天隨機選擇其中的1種方法對實驗的2組大鼠施以應激，模擬人類在社會生活中每天應對的不同精神壓力。本實驗中檢測了應激調節指標如血糖、ACTH濃度，結果顯示接受應激刺激的2組大鼠血糖和ACTH水平明顯高于正常對照組和牙周炎組，單純應激組在2周和4周時血糖和ACTH水平顯著升高，在4周后血清ACTH水平明顯下降，同時組織學觀察到牙周組織無任何破壞，表明動物在應激早期處于應激狀態, 其內分泌系統對應激刺激發生反應, 同時生物體也能進行適應性調節，4周后應激調節指標逐漸下降，可是ACTH血清水平仍高于正常組和牙周炎組，提示ACTH水平的升高可能與慢性心理應激所致機體缺氧狀態下的免疫反應之間有密切聯系。牙周炎+應激組在各個觀察時點血糖和ACTH水平均處于較高水平，牙周組織炎癥和牙槽骨吸收較牙周炎組明顯，表明應激能調節牙周炎的發生、發展及牙槽骨喪失過程。

乳酸脫氫酶是催化乳酸和丙酮酸相互轉換的酶。在厭氧酵解時，催化丙酮酸接受由3-磷酸甘油醛脫氫酶形成的NADH的氫，形成乳酸。它有LDH1～5共5個同工酶，這5個同工酶是由H型和M型2個亞基排列組合而成的四聚體雜聚分子，其中LDH1與LDH5分別是H4與M4。LDH1主要分布在有氧代謝為主的器官，如心臟，而LDH5則相反。有研究發現LDH1對乳酸的親和力更強，并且可被很低濃度的丙酮酸鹽抑制。氧供應充足時LDH1可以催化乳酸生成丙酮酸以獲取能量，LDH5則在厭氧條件下進行糖酵解。Dawson等[13]發現,用猴心肌細胞、雞心肌細胞和新生鼠腎細胞在減少氧分壓情況下，M型亞基增加，提高氧分壓則H型亞基合成增加。在新生兒缺氧缺血性腦病中研究結果顯示，輕、中、重度患兒LDH水平顯著高于正常對照組[14]。王愛華等[15]在急性心肌梗塞(AMI)和同時伴有并發癥患者中發現AMI電泳結果LDH1顯著增高，而在AMI伴有并發癥患者中LDH1降低，LDH5升高，原因是伴心衰或發生心源性休克的病人全身組織缺氧缺血，機體產生無氧代謝，受損的細胞向血液中釋放LDH5所致。本實驗結果表明牙周炎+應激組血清LDH在各時點明顯升高，而LDH1水平明顯下降，提示應激加重了牙周炎的缺氧狀態，導致牙周炎癥的加重及牙槽骨的破壞。

綜上所述，單純應激不會直接導致牙周炎，但是牙周炎患者在應激刺激時通過機體的內分泌-免疫應答系統可能導致牙周組織處于相對乏氧狀態，從而加重牙周組織的病變。

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InfluenceofchronicpsychologicalstressonperiodontitisandserumisoenzymeLDH1inrats

HUANG Shi-guang1, WANG Xiao-ge1, PAN Qian-ru1, HUANG Bo2, Lü Fang-li2, YE Xiu-hua1, YANG Yun-zhen1, GUO Liu-ting1, LIAN Chu-wen1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofParasitology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:fanglilu@yahoo.com)

AIM: To investigate the role of chronic psychological stress on periodontitis and serum level of isoenzyme LDH1 in rats.METHODSEighty female special pathogen-free Wistar rats were randomly divided into 4 groups:(1) normal control group; (2) experimental periodontitis group: the periodontitis model was induced by wrapping 3/0 silk ligature inoculated with putative periodontopathic bacteria around the left maxillary second molar of the rats; (3) psychological stress stimulation group: the rats were treated with stress stimulation alone; (4) periodontitis model with stress stimulation group: the periodontitis models were induced by wrapping 3/0 silk ligature inoculated with putative periodontopathic bacteria around the left maxillary second molar of the rats, and then treated with stress stimulation. The rats were sacrificed at 2nd, 4th, 6th and 8th weeks after ligature. The levels of blood glucose and adrenocorticotropic hormone (ACTH) were measured as the stress markers, and the serum isoenzyme lactate dehydrogenase 1(LDH1) was used to evaluate the severity of hypoxia. The histological changes of periodontal tissues were observed under microscope with HE staining.RESULTSThe levels of blood glucose and ACTH in stress group and periodontitis with stress group were significantly higher than those in control group and experimental periodontitis group at the 2nd and 4th weeks after ligature (P<0.01). The level of serum LDH in periodontitis with stress group was significantly higher than that in control group. The level of serum LDH1 in periodontitis with stress group was significantly lower than that in control group (P<0.01). No difference of histological change in periodontal tissues was observed in control group and stress group. Severer inflammatory changes and alveolar bone destruction were observed in periodontitis with stress group than those in experimental periodontitis group.CONCLUSIONStress stimulation is one of the inducing factors of periodontitis in rats that aggravates periodontitis by decreasing the tissue oxygenation.

Periodontitis; Models,animal; Psychological stress; Lactate dehydrogenase

R78

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.028