Akt與ERK1/2在人骨關節炎軟骨細胞中的表達*

程 亮， 趙洪海， 曾國慶， 張同恩， 王少杰， 石 磊， 王承云， 夏 春，△

(1福建醫科大學協和臨床醫學院， 福建 福州 350000； 2廈門大學附屬中山醫院骨關節科， 福建 廈門 361000)

1000-4718(2012)05-0889-06

2011-10-26

2012-02-29

福建省自然科學基金資助項目(No.2010D007)；福建省醫學創新課題資助(No. 2011-CXB-36)

△通訊作者 Tel: 0592-2993080; E-mail: chunxia99@yahoo.com.cn

Akt與ERK1/2在人骨關節炎軟骨細胞中的表達*

程 亮1， 趙洪海2， 曾國慶2， 張同恩2， 王少杰2， 石 磊2， 王承云2， 夏 春1，2△

(1福建醫科大學協和臨床醫學院， 福建 福州 350000；2廈門大學附屬中山醫院骨關節科， 福建 廈門 361000)

目的觀察蛋白激酶B(Akt)與細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)在正常和骨關節炎(OA)軟骨細胞中的表達，探討Akt與ERK1/2在OA病程中的意義。方法手術中取5例正常和18例OA人膝關節軟骨組織，包埋制備切片，免疫組織化學技術觀察 p-Akt及p-ERK1/2在正常和OA 軟骨組織中的表達；培養人軟骨細胞，甲苯胺藍染色、免疫組化鑒定并觀察聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原在正常和OA軟骨細胞中的表達； Western blotting技術檢測Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、磷酸化70 kD核糖體蛋白S6激酶(p-p70S6K)及增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白在正常和OA軟骨細胞中表達水平； 實時熒光定量PCR技術檢測聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原在正常和OA軟骨細胞中mRNA表達水平。結果與正常軟骨細胞比較，OA軟骨細胞內p-Akt和p-p70S6K蛋白表達明顯降低(P<0.05)，且聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原mRNA和蛋白在OA軟骨細胞中的表達水平降低(P<0.05)，而 p-ERK1/2和PCNA蛋白表達明顯提高(P<0.05)。結論Akt可能通過p-p70S6K來調控OA軟骨細胞外基質聚集蛋白聚糖及II型膠原的合成，ERK1/2可能通過PCNA來調控OA軟骨細胞增殖；Akt與ERK1/2可能參與了OA的病理過程。

骨性關節炎； 軟骨細胞； 蛋白激酶B； 細胞外信號調節MAP激酶類； 蛋白合成； 細胞增殖

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是一種以關節軟骨的變性、破壞及骨質增生為特征的慢性關節病,是引起中老年人關節疼痛的常見原因之一。流行病學調查表明,55歲以上中老年人OA的發病率為44%～70%,其中10%表現為各種功能障礙，且65歲以上的人群中的OA發病率男性為60%,女性為70%[1-2]。隨著世界老齡化人口的增加,OA的發病率也呈現逐年上升趨勢。軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞，在軟骨形成、代謝以及修復中起著舉足輕重的作用[3]。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱Akt)是絲氨酸/酪氨酸家族成員之一，可促進細胞合成信號的轉導，研究發現激活Akt可促進人骨性關節炎軟骨細胞Ⅱ型膠原(type II collagen, COL2)、聚集蛋白聚糖(aggrecan,AGG)等分泌增多[4]。同時，細胞外信號調節蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)可促進細胞增殖信號的轉導，激活ERK1/2信號通路可促進人骨性關節炎軟骨細胞增殖，而ERK1/2特異性抑制劑可抑制細胞增殖反應[5]。但是，有關這2種信號分子在OA軟骨細胞中的表達及相關功能了解尚少，本實驗取人正常和OA組織制備切片；建立人正常和OA軟骨細胞體外培養體系，觀察p-Akt和p-ERK1/2 在正常和OA軟骨組織及細胞中的表達差異，以期為臨床探討OA的病理生理提供一定的理論依據。

材 料 和 方 法

1標本

OA膝關節軟骨組織取材自接受膝關節表面置換的 OA患者[18人，男性8 人，女性 10 人，平均年齡 62.7 歲(53～72歲) ]。OA 診斷依據美國風濕病協會 2001 年版指南。正常軟骨組織取材于因車禍需截肢患者[5人，男性 4人，女性 1人，平均年齡27歲(18～35 歲) ]，排除關節疾病病史。軟骨標本取材均經過患者或家屬知情同意。

2方法

2.1軟骨細胞的分離、培養、細胞爬片及鑒定 術中無菌條件下取軟骨，迅速在冷凍條件下帶入無菌操作臺，置于含雙抗(HyClone)的PBS液中將軟骨剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入含 0.02% EDTA 的0.25%胰蛋白酶(Gibco)在37 ℃溫箱孵30 min，1 000 r/min 離心7 min，棄上清，加入0.2%Ⅱ型膠原酶(Sigma)在37 ℃溫箱消化過夜[6]，200目濾網過濾，離心棄上清，PBS液漂洗3次，收集細胞，加入含10% 胎牛血清(Gibco)的高糖 DMEM 培養基(HyClone)，將細胞均勻接種于培養皿中，置于 37 ℃、5% CO2培養箱內進行原代培養。倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并細胞爬片行甲苯胺藍染色(購自國藥集團化學試劑有限公司)及Ⅱ、Ⅹ型膠原免疫細胞化學染色鑒定(試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司)。

2.2Western blotting檢測 貼壁生長的人軟骨細胞長至70%～80%匯合，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，收集細胞，加入適量RIPA裂解液(購自上海碧云天生物技術有限公司)[含1%PMSF(Sangon)、1%蛋白磷酸酶抑制劑(購自普利萊基因技術有限公司)和1%DTT(Sangon)],充分混勻，冰水浴45 min，每間隔5 min振蕩混均1次；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清， BCA蛋白檢測試劑盒(Pierce)定量，-20 ℃保存。取40 μg細胞總蛋白按常規方法進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移法將蛋白印跡轉移至PVDF膜(GE)上，5%脫脂奶粉封閉。Ⅰ抗4 ℃過夜[Akt抗體、p-Akt抗體、ERK1/2抗體、p-ERK1/2抗體和磷酸化70 kD核糖體蛋白S6激酶(phosphorylated 70-kD ribosomal protein S6 kinase,p-p70S6K)抗體購自Cell Signaling Technology，稀釋度分別為：1∶4 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶3 000；GAPDH抗體和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體購自Epitomics，稀釋度分別為1∶4 000和1∶1 000]；Ⅱ抗為HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG(Proteinteach Group)，25 ℃恒溫下1 h，ECL(Millipore)發光法測定反應條帶灰度值，以GAPDH作為內參照，計算相對值。

2.3實時熒光定量PCR檢測 取對數生長期細胞，經Trizol(Invitrogen)法抽提細胞總RNA，定量。逆轉錄條件為：42 ℃逆轉錄60 min，-20 ℃保存。Real-time PCR條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環40次。反應體系構成: cDNA 模板2 μL、MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×) (Fermentas)10 μL、上下游引物(300 nmol/L)各 1 μL、DEPC H2O 6 μL；引物序列見表1[7]；PCR反應采用 Applied Biosystems 7500系統(ABI) ，觀察AGG和COL2 mRNA在正常和 OA軟骨細胞之間的表達差異，實驗重復 3 次。組間差異應用 2-ΔΔCt法計算。產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，一般恒壓130 V、30 min即可,Bio-Rad凝膠成像系統顯像。

表1 Real-time PCR 引物序列

2.4免疫組化檢測 術中取材的軟骨組織4%多聚甲醛固定1周， EDTA脫鈣液脫鈣2周，修整組織標本后梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(厚度 4 μm)，貼片后經60 ℃烘烤過夜。二甲苯、乙醇梯度入水，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min，然后用抗原修復液進行抗原修復。滴加過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育10 min后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min，滴加正常非免疫動物血清，室溫孵育10 min后，滴加Ⅰ抗，4 ℃過夜。用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min，滴加生物素標記的第Ⅱ抗體，室溫孵育10 min后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物溶液，室溫孵育10 min后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。添加 DAB 顯色，顯微鏡下觀察3～10 min，充分水洗后蘇木素復染，自來水沖洗返藍，再經過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察結果，圖像資料導入 Image-Pro Plus 6.0 軟件進行分析。陽性表達細胞判定標準為: 細胞內出現棕色染色的顆粒或斑塊,并采用細胞內顆粒或斑塊表達量進行定量分析。

3統計學處理

結 果

1軟骨細胞的形態及鑒定

分離培養的軟骨細胞外觀呈多角形，胞質豐富，胞核清楚，核為圓形或橢圓形，位于胞體中心，核仁為1～3個，細胞折光性好，且呈集落生長。甲苯胺藍染色使正常軟骨細胞胞漿呈藍色，可見1～3個核仁，呈紫藍色,見圖1 A1；OA軟骨細胞相對于正常軟骨細胞，胞漿染色稍淺,見圖1A2。正常軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組化染色呈陽性反應，細胞胞漿內有黃色顆粒，胞核基本無著色,見圖1B1；OA軟骨細胞相對于正常軟骨細胞，胞漿顆粒顏色稍淺,見圖1B2。正常軟骨細胞X型膠原免疫組化染色呈強陽性反應，細胞胞漿和胞核內均有棕黃色顆粒,見圖1C2；OA軟骨細胞相對于正常軟骨細胞，胞漿和胞核內顆粒顏色稍深,見圖1C1。

2人正常和OA軟骨細胞中Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p70S6K和PCNA的表達水平

Western blotting檢測顯示,OA軟骨細胞中Akt和ERK1/2表達水平與正常軟骨細胞相比無明顯差異(P>0.05),見圖2；與正常軟骨細胞相比，OA軟骨細胞中p-Akt和p-p70S6K表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05),見圖2；OA軟骨細胞中p-ERK1/2和PCNA表達水平與正常軟骨細胞相比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。

3人正常和OA軟骨細胞中COL2和AGGmRNA的表達水平

Real-time PCR結果顯示，與人正常軟骨細胞相比，OA軟骨細胞中COL2和AGG mRNA表達水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。

Figure 1. The identification of the normal and osteoarthritic (OA) chondrocytes.A1: the expression of aggrecan in OA chondrocytes(toluidine blue staining,×200)；A2：the expression of aggrecan in normal chondrocytes(toluidine blue staining,×200)；B1: the expression of type II collagen in OA chondrocytes(immunocytochemical staining,×200)；B2：the expression of type II collagen in normal chondrocytes(immunocytochemical staining,×200)；C1：the expression of type X collagen in normal OA chondrocytes(immunocytochemical staining,×200)；C2：the expression of type X collagen in normal chondrocytes(immunocytochemical staining,×200).

圖1正常和OA軟骨細胞的鑒定

圖2正常和OA細胞中Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p70S6K和PCNA蛋白表達水平

4人正常和OA軟骨組織中Akt和ERK1/2表達水平

免疫組化結果顯示正常和OA軟骨組織內軟骨細胞中均有p-Akt表達，分布在細胞胞漿內；且p-Akt在OA軟骨組織中整體表達水平低于正常軟骨組織,見圖4A、B。而正常和OA軟骨組織內軟骨細胞胞漿與胞核中均表達p-ERK1/2，但p-ERK1/2在OA軟骨組織中整體表達水平明顯高于正常軟骨組織，見圖4C、D。

討 論

傳統觀點認為軟骨基質的合成和降解失衡是OA的主要發病機制，軟骨細胞作為軟骨組織中唯一的細胞，在細胞外基質(即膠原和蛋白聚糖)的合成、分解以及相應功能的維持方面具有重要作用。在OA病變過程中，軟骨細胞經歷了肥大分化、終末分化、礦化等變化過程，而細胞功能也隨之發生變化，即合成分泌的膠原和蛋白多糖的類型發生改變以及受到病理刺激后的反應性增殖等。如軟骨細胞病變可引起細胞外基質包括膠原蛋白類型及聚集蛋白聚糖分子大小等顯著改變，對OA的發生、發展產生決定性的影響[8];正常軟骨細胞是沒有增殖能力的,而OA軟骨細胞與之相比有一定的增殖能力[9]。因此,軟骨細胞的功能調節是OA病程的關鍵。

圖3正常和OA軟骨組織細胞中II型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA表達水平

Figure 4. p-Akt and p-ERK1/2 expression in the normal and OA cartilage (immunohistochemical staining,×400).A: the expression of p-Akt in OA cartilage；B: the expression of p-Akt in normal cartilage；C: the expression of p-ERK1/2 in OA cartilage；D: the expression of p-ERK1/2 in normal cartilage.

圖4p-Akt和p-ERK1/2在正常和OA軟骨組織中的表達

眾多信號通路參與軟骨細胞的調節，其中作為PI3K-Akt信號通路的關鍵酶，已有研究顯示Akt通過磷酸化作用后使其活化，導致AGG和COL2合成和表達顯著上升，抑制PI3K/Akt可使軟骨細胞AGG和COL2合成下降[10]。

前期工作及本實驗均顯示OA軟骨組織中p-Akt表達降低[11]，并且這里還證實p-Akt表達在OA軟骨細胞中明顯下降，并且其下游底物之一p70S6K的磷酸化水平也同步下降，表明OA 中Akt/p70S6K通路受到抑制。p70S6SK作為Akt的下游激酶，其發生磷酸化可導致核糖體蛋白合成的開始和增加。進一步觀察顯示作為軟骨基質主要成分的AGG和COL2在OA軟骨細胞內的mRNA水平也呈下降趨勢。即與正常關節軟骨細胞比較，在OA軟骨細胞中伴隨Akt/p70S6K的抑制，AGG和COL2 mRNA水平也出現同步下降，結合以往學者的觀察結果,提出OA軟骨細胞內Akt/p70S6K通路的抑制可能與AGG和COL2 mRNA水平降低相關，推測可能正是Akt/p70S6K的抑制導致軟骨細胞正常分化表型COL2和AGG表達水平下降。當然Akt/p70S6K的通路受抑制不僅限于對蛋白合成的影響，可能也涉及到細胞增殖、存活調節等，其作用機制有待進一步研究。

MAPK-ERK1/2信號通路是把細胞外信號轉導到核內調控基因表達的重要細胞內信號分子，是不同促增殖因子調控的共同通路，參與多種細胞的增殖、分化[12]。本研究結果顯示p-ERK1/2在OA軟骨細胞中表達水平較正常軟骨細胞呈現上調趨勢，并在組織中也發現了p-ERK1/2在OA軟骨組織中的表達上調。而且同時我們檢測到作為細胞增殖狀態指標之一的PCNA[13]在OA軟骨細胞中表達呈上調趨勢，揭示出OA軟骨細胞增殖能力可能強于正常軟骨細胞。顯而易見，ERK1/2參與調控OA軟骨細胞的病理改變，并可能通過調控PCNA而致OA軟骨細胞增殖能力增加。

眾所周知OA的病理發展是一個復雜的并受多種信號通路調節影響的過程，它不受任一信號通路(包括Akt和ERK1/2)單獨調節。在任何時候軟骨細胞內都有大量信號通路的激活，各信號通路之間的相互串話、正負反饋循環以及大量信號整合的結果決定軟骨細胞最后的反應(包括軟骨細胞的合成代謝、分解代謝、細胞增殖、細胞凋亡等等)。例如有研究表明Akt信號通路也參入調控OA軟骨細胞增殖，ERK1/2信號通路也參入調控OA軟骨細胞蛋白合成[9-14]。雖然本文的結果支持Akt的生物功能可能與OA軟骨細胞蛋白合成功能相關聯，ERK1/2的生物功能可能與OA軟骨細胞增殖相關聯，但軟骨細胞 II 型膠原等產物的合成代謝可能受到其它信號調控因子的綜合影響，不能以Akt調控“一元論”解釋；軟骨細胞的增殖反應也可能受到其它信號調控因子的綜合影響，不能以ERK1/2調控“一元論”解釋；如生長激素、表皮生長因子、胰島素、腫瘤壞死因子-α等也參入軟骨細胞的合成代謝、分解代謝、細胞增殖、細胞凋亡等調控[15-17]。

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ExpressionofAktandERK1/2inhumanosteoarthriticchondrocytes

CHENG Liang1, ZHAO Hong-hai2, ZENG Guo-qing2, ZHANG Tong-en2, WANG Shao-jie2, SHI Lei2, WANG Cheng-yun2, XIA Chun1,2

(1UnionSchoolofClinicalMedicine,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350000,China;2DepartmentofOrthopaedics,ZhongshanHospitalofXiamenUniversity,Xiamen361000，China;E-mail:chunxia99@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the expression of protein kinase B (Akt) and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) in normal and osteoarthritic chondrocytes.METHODSThe samples of knee cartilage were obtained from the normal donors (n=5) and the patients (n=18) undergoing total knee arthroplasty with the diagnosis of osteoarthritis (OA). The expression of p-Akt and p- ERK1/2 in the normal and osteoarthritic cartilage tissues was detected by the method of immunohistochemistry. The chondrocytes were isolated and identified by toluidine blue staining and immunohistochemical method. The expression levels of Akt, p-Akt, ERK1/2,p-ERK1/2,phosphorylated 70-kD ribosomal protein S6 kinase(p-p70S6K) and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) were tested in normal and osteoarthritic chondrocytes by Western blotting. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to measured the expression levels of aggrecan and type II collagen gene in normal and osteoarthritic chondrocytes.RESULTSThe expression of p-Akt in normal cartilage was higher than that in OA cartilage. The expression of p- ERK1/2 in OA cartilage was higher than that in normal cartilage. Compared with the normal chondrocytes, the expression of p-Akt and p-p70S6K, and the mRNA levels of aggrecan and type II collagen were increased (P<0.05), and the expression of p-ERK1/2 and PCNA was decreased in OA chondrocytes (P<0.05).CONCLUSIONAkt might regulate aggrecan and type II collagen synthesis via p-p70S6K, and ERK1/2 might regulate OA chondrocyte proliferation through PCNA. Both Akt and ERK1/2 play important roles in the pathogenesis of OA.

Osteoarthritis; Chondrocytes; Protein kinase B; Extracellular signal-regulated MAP kinases; Protein synthesis; Cell proliferation

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.021