鹽霉素抑制人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP增殖及誘導凋亡的機制

曾 葭， 劉成成， 祝愛珍， 陳小宇， 譚廣銷， 劉革修△

(1中國人民解放軍411醫院呼吸內科，上海 200081；2暨南大學醫學院血液病研究所, 廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)05-0834-05

2012-03-02

2012-03-12

△通訊作者 Tel:020-85220262; E-mail:tliugx@jnu.edu.cn

鹽霉素抑制人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP增殖及誘導凋亡的機制

曾 葭1， 劉成成2， 祝愛珍2， 陳小宇2， 譚廣銷2， 劉革修2△

(1中國人民解放軍411醫院呼吸內科，上海 200081；2暨南大學醫學院血液病研究所, 廣東 廣州 510632)

目的探討鹽霉素對人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP增殖的抑制作用及其可能機制。方法采用MTT法檢測鹽霉素對A549/DDP細胞生長的抑制作用；流式細胞術檢測鹽霉素對A549/DDP細胞凋亡及線粒體膜電位(ΔΨm)的影響；比色法檢測caspase-3、8和9活性；Western blotting分析細胞色素C、Bcl-2、Bax、β-catenin和磷酸化低密度脂蛋白受體相關蛋白6(p-LRP6)蛋白水平。結果鹽霉素對A549/DDP細胞生長具有劑量依賴性抑制作用。0.2 μmol/L鹽霉素作用于A549/DDP細胞，ΔΨm顯著下降，而細胞內活性氧和Ca2+濃度在短期顯著升高，胞漿細胞色素C蛋白水平、caspase-3、8和9酶活性均顯著增加，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.01)；Bcl- 2 的表達下調，Bax 的表達明顯增加，Bcl-2/Bax 比值顯著降低。48 h時增殖抑制率為(34.61±1.97)%，細胞凋亡率為(18.74±2.08)%。鹽霉素也減少A549/DDP細胞內β-catenin和p-LRP6蛋白水平。結論鹽霉素通過抑制Wnt信號通路抑制A549/DDP細胞增殖，通過Bcl-2/Bax途徑和線粒體凋亡途徑誘導人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP凋亡。

鹽霉素; 肺腫瘤; 順鉑; 細胞凋亡; β-catenin; 低密度脂蛋白受體相關蛋白6

肺癌是目前發生率與死亡率最高的惡性腫瘤,其中以非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)為主,而且NSCLC患者確診時多數已到晚期，手術難以徹底清除,以鉑類為基礎的兩藥聯合化療方案和表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)是當前針對EGFR基因突變的晚期NSCLC患者首選治療措施,但對EGFR基因不存在突變者只有少數治療有效，而且多數容易出現耐藥復發現象。越來越多的研究表明,腫瘤耐藥與復發的根本原因是腫瘤干細胞的存在。因此，尋找新的清除腫瘤干細胞的藥物以減少耐藥與復發十分必要。最近Gupta等[1]研究發現一種名為鹽霉素(salinomycin)的抗生素可以直接殺死腫瘤干細胞，其殺死小鼠乳腺癌干細胞的效力比普通抗癌藥物泰克索(Taxol)高100倍。本實驗觀察鹽霉素對人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP增殖的抑制作用及其可能機制，為鹽霉素應用于肺腺癌治療探索新的思路。

材 料 和 方 法

1主要試劑

鹽霉素(S4526)、臺盼藍(T0776)、Triton X-100(T8787)、DMSO(D2650)和PI染料(P4170)購自Sigma, RPMI-1640 培養液(R0883)和胎牛血清(10082-139)購自Gibco，細胞內活性氧(S0033)、caspase-3酶活性(C1115)、caspase-8酶活性(C1152)、caspase-9酶活性(C1158)以及JC-1線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)檢測試劑盒(C2006)購自碧云天生物技術有限公司，細胞色素C凋亡檢測試劑盒(Catalog BioVision)，Fluo-3AM(Biotium)，Epics XL 型流式細胞儀(Beckman Coulter)。

2細胞和細胞培養

人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP購自中南大學湘雅醫學院細胞中心。用含10% 胎牛血清、100 mg/L青霉素及100 mg鏈霉素的 RPMI-1640培養液置于含5% CO2、飽和濕度、37 ℃孵箱中培養，2～3 d傳代。

3鹽霉素對細胞生長的抑制作用

檢測鹽霉素對A549/DDP細胞的劑量-效應關系時，取對數生長期細胞，調整密度為5×107/L，每孔180 μL，鹽霉素設有0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 μmol/L濃度梯度，設5個復孔，同時設DMSO對照孔和不加細胞的調零孔，5%CO2、飽和濕度、37 ℃孵育48 h，每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，37 ℃培養4 h后低速離心10 min,吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min使沉淀充分溶解，用酶標儀在波長490 nm處測定吸光度(A)值。細胞生長抑制率=(實驗組平均A值-空白組平均A值)/(對照組平均A值-空白組平均A值)×100%。采用直線回歸方法計算藥物的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值。繪制0.2 μmol/L鹽霉素對A549/DDP細胞的時間-效應曲線，孵育時間：0、24、48、72、96 h，測量方法同上。

4AnnexinV-PI雙染測定細胞凋亡

取對數生長的A549/DDP細胞，每孔2×105個細胞接種至12孔板內，設鹽霉素(0.2 μmol/L)處理組、鹽霉素(非細胞毒性濃度0.1 μmol/L)與順鉑(2 mg/L)聯合處理組、單純順鉑(2 mg/L)組和對照組，對照組加入1% DMSO，作用48 h后，消化收集細胞，PBS 洗滌，棄上清，加入200 μL結合緩沖液，重懸細胞后，分別加入10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，4 ℃避光反應30 min，再加入300 μL結合緩沖液，上機檢測。

5ΔΨm、活性氧和胞質Ca2+釋放的檢測

取對數生長期的A549/DDP細胞，以每孔2×105個細胞接種至12孔板，加入鹽霉素(0.2μmol/L)處理，在6 h、12 h、24 h時收集細胞，PBS洗滌2遍。500 μL JC-1(10 mg/L)重懸細胞檢測ΔΨm，500 μL DCFH-DA (5 μmol/L)重懸細胞檢測細胞產生的活性氧，10 μmol/L熒光染料 Fluo-3AM檢測細胞內Ca2+濃度，37 ℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，即刻用流式細胞儀檢測，激發波長為488 nm, 發射波長為530 nm。

6檢測caspase-3、caspase-8和caspase-9活性

取對數生長期的A549/DDP細胞，以每孔2×105個細胞的密度接種至12孔板，加入鹽霉素(0.2 μmoL/L)，分別處理0、12、24 h, 按照試劑盒說明收集細胞，預冷PBS洗滌后重懸于細胞裂解液中，冰上裂解30 min，4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清加入顯色底物(caspase-3底物Ac-DEVD-pNA、caspase-8底物Ac-IETD-pNA和caspase-9底物Ac-LEHD-pNA)，終濃度50 μL/L，均勻混合并加入到96孔板中，每組5個復孔，避光孵育4 h，酶標儀在波長405 nm處檢測A值。

7Westernblotting檢測蛋白水平

取對數生長期的A549/DDP細胞，分別以0.2 μmoL/L鹽霉素處理48 h，收集細胞PBS洗2遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白；細胞色素C凋亡測定是按試劑盒抽提胞漿及線粒體蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑測定蛋白濃度，取蛋白50 μg，經10% SDS-PAGE電泳分離，常規轉移至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉液(20 mmol/L Tris,pH 7.6;0.1% Tween 20)封閉過夜。鼠抗人細胞色素C、Bcl-2、Bax、β-catenin抗體(Santa Cruz)、磷酸化低密度脂蛋白受體相關蛋白6(phosphorylated low-density lipoprotein receptor-related protein 6,p-LRP6) (Ser1490)抗體 (Cell Signaling Technology)或GAPDH (Chemicon International) 4 ℃孵育過夜，1∶2 000 稀釋的HRP 標記的山羊抗小鼠Ⅱ抗室溫孵育1 h，用TBST洗3次，ECL顯色液顯色。目的條帶用Image-Pro Plus分析軟件進行灰度值分析，以GAPDH內參照校正。

8統計學處理

結 果

1鹽霉素對A549/DDP細胞抑制生長和誘導凋亡的作用

鹽霉素在0.1～1.6 μmoL/L之間對A549/DDP細胞的生長抑制作用呈劑量依賴性：0.1 μmoL/L即有明顯作用，0.2、0.4、0.8和1.6 μmoL/L鹽霉素增殖抑制率分別為(34.61±2.97)%、(59.64±3.23)%、(83.75±3.32)%和(95.74±3.47)%，P<0.05，見圖1A。根據實驗數據計算得IC50=0.33 μmoL/L。0.2 μmoL/L鹽霉素處理A549/DDP細胞24 h時即顯示明顯增殖抑制作用[(17.93±2.18)%]，隨著時間延長抑制作用越來越明顯，72 h細胞抑制率(51.43±3.24)%，96 h為(64.58±3.38)%，見圖1B。流式細胞儀檢測結果顯示0.2 μmoL/L鹽霉素能夠誘導A549/DDP細胞凋亡，出現明顯亞G1二倍體峰，且隨著時間的增加，作用越明顯，48 h時細胞凋亡(18.74±2.08)%，見圖2。

圖1鹽霉素對A549/DDP細胞的生長抑制作用

Figure 2. Salinomycin induced apoptosis of A549/DDP cells.

圖2鹽霉素誘導A549/DDP細胞凋亡

2鹽霉素對A549/DDP細胞ΔΨm、活性氧和細胞內Ca2+濃度的影響

0.2 μmoL/L鹽霉素作用于A549/DDP細胞之后，ΔΨm在6 h時已顯著下降，24 h時下降至最低，為對照組的(21.7±2.3)%；細胞內活性氧在6 h時已顯著升高，24 h時仍然高于對照組水平[(142.7±4.3)%]；細胞內Ca2+濃度在6 h時已顯著升高，為對照組的(154.9±5.6)%，24 h時下降至接近對照組水平，見圖3。

圖3鹽霉素對A549/DDP細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內Ca2+的影響

3鹽霉素對A549/DDP細胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性的影響

0.2 μmol/L鹽霉素處理A549/DDP細胞后，隨著時間的增加，caspase-3、caspase-8和caspase-9

的活性逐漸增加，呈時間-效應關系，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4。這表明caspase-3、caspase-8和caspase-9參與了鹽霉素的凋亡途徑。

圖4鹽霉素對A549/DDP細胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性的影響

4鹽霉素對A549/DDP細胞Bcl-2、Bax、細胞色素C、β-catenin和p-LRP6蛋白水平的影響

0.2 μmol/L鹽霉素作用A549/DDP細胞48 h，不僅Bcl- 2 表達下調，Bax 表達明顯增加，使Bcl-2/Bax 比值顯著降低，而且胞漿細胞色素C 顯著增加，Wnt信號通路β-catenin和p-LRP6蛋白水平也顯著下降，見圖5。這說明鹽霉素影響了Bcl-2/Bax和細胞色素C這2條凋亡途徑，同時抑制A549/DDP細胞Wnt信號通路。

圖5鹽霉素對A549/DDP細胞中細胞色素C、Bcl-2、Bax、β-catenin和p-LRP6蛋白水平的影響

討 論

鹽霉素屬于聚醚類一元羧酸，由白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)發酵產生，具有特殊的環狀結構，是典型的離子載體抗生素，它對細胞中的陽離子，尤其K+、Na+、Rb+的親和力特別強，使生物所必需的陽離子通過膜上脂質屏障的浸透性增強，妨礙細胞內外陽離子的傳遞，使細胞內外離子濃度發生變化，從而影響滲透壓，最終使細胞崩解，起到殺菌作用。

細胞凋亡程序是一個復雜的、涉及多基因的過程，主要有線粒體和細胞表面受體介導這兩條途徑。Bcl-2家族、線粒體細胞色素C及caspase是細胞內凋亡信號通路的基本成分[2-5]。Caspase被認為是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白，一旦活化發生級聯反應，凋亡即進入不可逆的階段。而caspase-3是caspase家族成員中最重要的效應型[6]。本研究結果顯示，鹽霉素對人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP細胞生長不僅具有劑量依賴性抑制作用，而且使ΔΨm下降、細胞色素C和Ca2+的釋放，增加細胞內活性氧，以及增加caspase-3、8和9酶活性，并使Bcl-2/Bax 比值顯著降低；流式細胞儀結果顯示細胞凋亡明顯增加。這些實驗結果說明鹽霉素通過Bcl-2/Bax途徑和線粒體凋亡途徑誘導人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP凋亡。另外，鹽霉素也減少A549/DDP細胞內β-catenin和p-LRP6蛋白水平。Wnt信號途徑對維持細胞生物學活性具有重要作用。最近研究顯示Wnt信號途徑與腫瘤干細胞增殖與自我復制及其耐藥密切相關[7-9]。所以，結果說明鹽霉素通過抑制Wnt信號途徑抑制A549/DDP細胞增殖。這些實驗結果對于改善肺腺癌臨床治療方法提供新的依據。但如何應用鹽霉素于肺腺癌臨床治療還有待進一步研究。

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Salinomycininhibitedproliferationandinducedapoptosisofcisplatin-resistanthumanlungadenocarcinomacelllineA549/DDP

ZENG Jia1, LIU Cheng-chen2, ZHU Ai-zhen2, CHEN Xiao-yu2, TAN Guang-xiao2, LIU Ge-xiu2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,ChinesePLA411Hospital,Shanghai200081,China;2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliugx@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of salinomycin on the proliferation and apoptosis of cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP.METHODSThe inhibitory effect of salinomycin on the growth of A549/DDP cells was tested by MTT methodinvitro. The apoptosis and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) of A549/DDP cells were assayed by flow cytometry. The activity of caspase-3, 8 and 9 was determined by the method of colorimetry. The levels of cytochrome C, Bcl- 2, Bax, β-catenin, and phosphorylated low-density lipoprotein receptor-related protein 6(p-LRP6) were measured by Western blotting.RESULTSSalinomycin inhibited the growth of A549/DDP cells in a dose-dependent manner. Salinomycin at concentration of 0.2 μmol/L decreased ΔΨmlevel, and increased reactive oxygen species (ROS), cytochrome C and cytosolic Ca2+release in the cells. Salinomycin also increased the acti-vity of caspase-3, 8, and 9 in the cells, reduced the ratio of Bcl-2/Bax, and decreased the levels of β-catenin and p-LRP6.CONCLUSIONSalinomycin depresses the cell growth by inhibiting Wnt signaling, and induces the apoptosis of cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP via mitochondria-dependent and Bcl-2/Bax pathways.

Salinomycin; Lung neoplasms; Cisplatin; Apoptosis; β-catenin; Low-density lipoprotein receptor-related protein 6

R743

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.012