人多發性骨髓瘤RPMI 8226細胞條件培養液誘導破骨前體細胞的分化成熟*

湯麗苑， 徐 鈺， 陳 瑾， 劉新華， 俞 康△

(1溫州醫學院附屬第一醫院血液科, 2溫州醫學院，3溫州醫學院血液腫瘤與移植免疫研究所，浙江 溫州 325000)

1000-4718(2012)04-0649-06

2011-08-26

2012-01-18

溫州醫學院5010重大項目子課題(No.XNK05005)

△通訊作者Tel:0577-88069517;E-mail：yukang62@126.com

人多發性骨髓瘤RPMI 8226細胞條件培養液誘導破骨前體細胞的分化成熟*

湯麗苑1， 徐 鈺2， 陳 瑾2， 劉新華3， 俞 康1△

(1溫州醫學院附屬第一醫院血液科,2溫州醫學院，3溫州醫學院血液腫瘤與移植免疫研究所，浙江 溫州 325000)

目的探討人多發性骨髓瘤RPMI 8226細胞條件培養液對破骨前體細胞RAW264.7的影響。方法Western blotting檢測可溶性核因子κB 受體激活劑配體(soluble receptor activator of NF-κB ligand, sRANKL)的蛋白表達?？咕剖崴嵝粤姿崦?tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色觀察RAW264.7細胞的分化成熟情況。RT-PCR法檢測RAW264.7細胞TRAP和cathepsin K mRNA的表達。結果Western blotting法證實RPMI 8226細胞條件培養液中含有sRANKL。TRAP染色發現RPMI 8226細胞條件培養液能誘導RAW264.7細胞分化為TRAP陽性的多核成熟破骨細胞。人抑制性RANKL單克隆抗體拮抗30%RPMI 8226細胞條件培養液中sRANKL的作用，且具有劑量依賴性。30% RPMI 8226細胞條件培養液能刺激RAW264.7細胞上調TRAP和cathepsin K mRNA表達。結論人多發性骨髓瘤細胞RPMI 8226條件培養液中的sRANKL具有促RAW264.7破骨前體細胞分化成TRAP陽性的多核成熟破骨細胞的生物活性。人抑制性RANKL單克隆抗體阻斷30%RPMI 8226細胞條件培養液中sRANKL的誘導分化作用，且具有濃度依賴性。

多發性骨髓瘤； 破骨細胞； 核因子κB受體激活劑配體

骨髓瘤骨病是多發性骨髓瘤的重要病理改變之一，是影響骨髓瘤患者生活質量和預后的重要因素。目前認為骨髓瘤骨病由骨重建失調所致，包括破骨功能增強和成骨功能減弱，新生骨質未能代償性增加,引起骨質破壞[1]。核因子κB受體激活劑(receptor activator of NF-κB, RANK)/RANK配體(RANK ligand,RANKL)和骨保護素(osteoprotegerin,OPG)系統與骨髓瘤骨病發病機制密切相關[2]，其靶向治療是目前研究的熱點[3-4]。本文建立骨髓瘤細胞誘導破骨細胞分化的細胞模型，探討人多發性骨髓瘤RPMI 8226細胞表達sRANKL對RAW264.7細胞分化成熟的影響，同時研究人抑制性RANKL單克隆抗體在其中的抑制作用，為今后靶向治療提供實驗和理論基礎。

材 料 和 方 法

1材料

人多發性骨髓瘤RPMI 8226細胞由浙江大學醫學院血液研究所金潔教授惠贈(ATCC，編號:CCL-155)。鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)購于北京協和醫科大學細胞庫(ATCC ，編號:TIB-71)。人成骨肉瘤細胞(MG-63) 購于武漢大學細胞保藏中心(CCTCC，編號:GDC074)。人抑制性RANKL單克隆抗體(RANKL mAb，型號：MAB6262)、人RANKL單克隆抗體MAB6263(用于Western blotting)和重組人RANKL蛋白(rhRANKL)購于R&D。TRAP染色試劑盒購于Sigma。Random Primer、逆轉錄酶、RNasin、dNTP、5×Reaction Buffer購于Fermentas。PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。Platinum PCR SuperMix購于Invitrogen。Amicon Ultra-15超濾管(15 mL，10 kD)購于 Millipore。ECL發光試劑盒購于Pierce。

2方法

2.1工作液的配制 RANKL mAb干粉500 μg用1 mL無菌PBS溶解，配成濃度為500 mg/L，分裝后-80 ℃儲存。MAB6263干粉100 μg用200 μL無菌PBS溶解，配成濃度為500 mg/L，分裝后-80 ℃儲存。rhRANKL干粉10 μg用0.2 mL無菌PBS溶解，配成濃度為50 mg/L，加入0.1%人白蛋白保持其活性，分裝后-80 ℃儲存。

2.2細胞培養和條件培養液及其濃縮液的收集 RPMI 8226細胞、RAW264.7細胞與MG-63細胞用10% FCS-DMEM培養基培養,培養條件為37 ℃、5 % CO2，2～4 d換液傳代。臺盼藍拒染實驗檢測活細胞率均在95%以上。RPMI 8226和MG-63細胞處于對數生長期時，以1×108/L密度傳代接至25 cm2細胞培養瓶內，培養2 d后將細胞懸液或上清液移至離心管中，200×g離心5 min后，取上清液，500×g離心10 min完全去除細胞后，收集條件培養液，-80 ℃凍存備用。RPMI 8226細胞條件培養液15 mL加入超濾管中，離心機甩平轉子4 000×g，30 min，取出濃縮液300 μL，稱量離心前后離心管重量，評估濃縮50倍，分裝后-80 ℃儲存。

2.3Western blotting法檢測 RPMI 8226細胞取對數生長期時傳代，以1×108/L密度接種于25 cm2的培養瓶中，培養2 d后分別通過離心獲取細胞，提取總蛋白。RPMI 8226細胞50×濃縮條件培養液和1×條件培養液經蛋白裂解后，將20 μL蛋白經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，轉移至PVDF膜，于搖床上封閉1.5 h，分別加入鼠抗人RANKL單克隆抗體(MAB6263)，4 ℃過夜，TBST充分漂洗。加入辣根過氧化物酶連接的羊抗鼠IgG室溫輕搖1.5 h，同上漂洗，與ECL化學發光試劑反應，常規方法顯色、定影。

2.4TRAP染色 根據試劑盒使用說明書的步驟進行。RAW264.7細胞以每孔1.5×104接種于6孔板，培養過夜后更換不同條件培養液(100 μg/L rhRANKL、30%MG-63細胞條件培養液、30%RPMI 8226細胞條件培養液以及0.00006 mg/L、0.0006 mg/L、0.006 mg/L、0.06 mg/L、0.6 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L不同濃度RANKL mAb加入30%RPMI 8226細胞條件培養液組)，第7 d TRAP 染色，細胞用4%多聚甲醛固定10 min后，加染色液，37 ℃避光水浴90 min 后，雙蒸水洗3 次,干燥后用中性樹脂封固，光鏡下(放大100倍)對各組每孔中TRAP陽性多核破骨細胞(≥3個核)進行計數,并攝片記錄。

2.5RT-PCR檢測 每培養孔加1.0 mL Trizol混勻，以一步法抽提總RNA，紫外分光光度法檢測RNA濃度和純度，計算各組A260/A280比值(> 1.8)。逆轉錄體系含RNA 1 μg，dNTP 2.0 μL，Oligo (dT)1 μL，M-MuLV逆轉錄酶1 μL，4×107U/L RNasin 0.25 μL，DEPC水補充至20 μL，42 ℃ 60 min，70 ℃10 min完成逆轉錄反應。PCR反應體系為Platinum PCR SuperMix 13 μL，cDNA 1 μL，引物1 μL。反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃ 1 min，36個循環，72 ℃ 10 min。以β-actin為內參照，PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，掃描條帶后用Quantity One軟件，以目的條帶與內參照條帶吸光度值之比作為目的基因mRNA相對含量，重復實驗3次。各引物和退火溫度見表1。

3統計學處理

表1RT-PCR引物及退火溫度

Table 1. Primers and annealing temperatures for RT-PCR

GenePrimersequenceTm(℃)β-actin(602bp)5’-gccatcctgcgtctggacctg-3’5’-catttgcggtgcacgatggag-3’58CathepsinK(324bp)5’-gggccaggatgaaagttgta-3’5’-ccgagccaagagagcatatc-3’55TRAP(101bp)5’-caccctgagatttgtggctgt-3’5’-cggttctggcgatctctttg-3’60

結 果

1Westernblotting法檢測sRANKL蛋白表達

RPMI 8226細胞表達跨膜型RANKL(mRANKL,43 kD)和 sRANKL (24 kD)。50×RPMI 8226細胞濃縮條件培養液發現sRANKL (24 kD)表達。但1×RPMI 8226細胞條件培養液未見表達，見圖1。

Figure 1. The expression of sRANKL protein detected by Western blotting. Lane 1:1×RPMI 8226 cell conditioned medium; Lane 2:RPMI 8226 cells; Lane 3:50×RPMI 8226 cell conditioned medium.

圖1Westernblotting檢測sRANKL蛋白的表達

2TRAP染色觀察RAW264.7細胞形態

TRAP染色觀察無誘導空白組RAW264.7細胞胞體較小，大部分細胞呈TRAP陰性單核細胞，少數為TRAP陽性的單核或多核細胞。rhRANKL、RPMI 8226細胞條件培養液和MG-63細胞條件培養液誘導組成熟破骨細胞數量明顯增多，胞體較大，形態不規則，呈油煎蛋形或漏斗形等，具有幾個到幾十個不等的細胞核(≥3個)，細胞邊緣見偽足樣突起，胞漿呈空泡狀，胞漿TRAP活性部位呈玫瑰紅色，細胞核為陰性，即為TRAP陽性多核成熟破骨細胞。加RANKL mAb組與無單抗組相比，TRAP陽性的多核細胞形態相似，但數量明顯減少，見圖2。

3TRAP陽性的多核破骨細胞計數

3.1100 μg/L rhRANKL、30% RPMI 8226細胞條件培養液與30% MG-63細胞條件培養液對RAW264.7細胞的誘導作用 3組條件培養液誘導的TRAP陽性多核破骨細胞數和空白組比較有顯著差別，P<0.01。100 μg/L rhRANKL誘導組比其它兩誘導組有明顯差異(P<0.01)，見圖3。

3.21 mg/L RANKL mAb抑制30% RPMI 8226細胞條件培養液與100 μg/L rhRANKL對RAW264.7細胞的誘導作用 1 mg/L RANKL mAb抑制30% RPMI 8226細胞條件培養液和100 μg/L rhRANKL誘導的TRAP陽性多核破骨細胞數明顯低于不加抗體組(P<0.01)。1 mg/L RANKL mAb阻斷30%RPMI 8226細胞條件培養液組與空白組無差別；而1 mg/L RANKL mAb阻斷100 μg/L rhRANKL組相比空白組差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 2. The morphological changes of RAW264.7 cells(TRAP staining,×100). A：control；B：100 μg/L rhRANKL；C：30%RPMI 8226 cell conditioned medium；D：30%MG-63 cell conditioned medium；E：100 μg/L rhRANKL +1 mg/L RANKL mAb；F：30%RPMI 8226 cell conditioned medium +1 mg/L RANKL mAb；G：30%RPMI 8226 cell conditioned medium +0.6 mg/L RANKL mAb.

圖2RAW264.7細胞株TRAP染色形態圖

圖3RPMI8226與MG-63細胞條件培養液、rhRANKL誘導RAW264.7細胞分化成熟的作用

3.3不同濃度RANKL mAb阻斷30% RPMI 8226細胞條件培養液誘導RAW264.7細胞分化的作用 0.6、1、1.5 mg/L RANKL mAb抑制組顯著抑制30% RPMI 8226細胞條件培養液誘導的破骨細胞分化成熟作用(P<0.01)。0.06 mg/L RANKL mAb抑制組也具有明顯抑制作用(P<0.05)。0.00006、0.0006與0.006 mg/L RANKL mAb抑制組則阻斷效果不明顯(P>0.05)，見圖5。

圖41mg/LRANKLmAb抑制30%RPMI8226細胞條件培養液與100μg/LrhRANKL誘導RAW264.7細胞分化成熟的作用

圖5RANKLmAb濃度依賴性阻斷30%RPMI8226條件培養液誘導分化作用的量效關系

4RAW264.7細胞的TRAP與cathepsinKmRNA表達

4.1TRAP mRNA表達 30% MG-63細胞條件培養液組、30% RPMI 8226細胞條件培養液組、100 μg/L rhRANKL組和30% RPMI 8226細胞條件培養液+0.6 mg/L mAb組的TRAP mRNA相對表達量明顯高于空白組，P<0.01。30% RPMI 8226細胞條件培養液+1 mg/L RANKL mAb組比其無抗體組TRAP表達量低(P<0.05)，見圖6。

4.2Cathepsin K mRNA表達 30% RPMI 8226細胞條件培養液組、30% RPMI 8226細胞條件培養液+0.6 mg/L和1 mg/L RANKL mAb組、100 μg/L rhRANKL組、100 μg/L rhRANKL +1 mg/L RANKL mAb組和30% MG-63細胞條件培養液組與空白組相比，cathepsin K mRNA表達增高(P<0.05)。其余組間均無顯著差異，見圖7。

討 論

多發性骨髓瘤起源于早期前B細胞惡性克隆，表現為骨質破壞、反復感染、高鈣血癥、貧血和腎功能不全等。骨髓瘤微環境中RANKL/OPG比例嚴重失衡，RANKL過度表達，OPG表達和活性降低，導致破骨細胞功能增強，骨損傷加重[5]。近年來，國內外學者針對RANKL/RANK/OPG系統進行靶向治療研究，如 Reuter等[6]報道信筒子醌能通過抑制RANKL來阻止骨髓瘤誘導的破骨細胞分化成熟。王藝華等[7]報道馬錢子堿能抑制骨髓瘤細胞對成骨細胞株RANKL的mRNA表達,上調堿性磷酸酶、骨鈣蛋白及OPG的mRNA表達，證明馬錢子堿對骨髓瘤的治療效果優于硼替佐米。但至今仍未有公認的RANKL/RANK/OPG系統靶向藥物應用于骨髓瘤。本實驗為此建立細胞模型, 研究RANKL在人骨髓瘤細胞RPMI 8226條件培養液誘導RAW264.7細胞分化成熟影響中的作用,并且為今后靶向治療奠定實驗基礎。

圖6各組TRAPmRNA表達

圖7各組誘導cathepsinKmRNA表達

本實驗采用單克隆抗體免疫沉淀法證實RPMI 8226細胞表達RANKL蛋白(包括mRANKL和sRANKL)，但檢測不到1×108/L RPMI 8226細胞條件培養液sRANKL蛋白表達，再將細胞培養液經超濾管濃縮50倍后可檢測到sRANKL蛋白。同時以MG-63細胞[8]條件培養液與rhRANKL為陽性對照，發現RPMI 8226細胞能明顯誘導RAW264.7細胞分化為TRAP陽性的多核破骨細胞。這與Lai等[9]報道的人骨髓瘤細胞NCI-H929和U266的條件培養液能誘導人骨髓單個核細胞分化為TRAP陽性的多核破骨細胞一致。同時1 mg/L人抑制性RANKL單克隆抗體能顯著阻斷30%RPMI 8226細胞條件培養液與100 μg/L rhRANKL誘導的RAW264.7細胞分化成熟作用，證明RPMI 8226細胞條件培養液中起誘導破骨細胞分化作用的重要成分為sRANKL。

高濃度抑制性RANKL單克隆抗體(0.6、1、1.5 mg/L)能顯著抑制30%RPMI 8226細胞條件培養液誘導破骨前體細胞分化成熟作用。中等濃度RANKL抗體(0.06 mg/L)也具抑制作用(P<0.05)。低濃度RANKL抗體(0.00006、0.0006、0.006 mg/L)抑制效果不明顯。說明人抑制性RANKL單克隆抗體阻斷30%RPMI 8226細胞條件培養液中sRANKL誘導的破骨細胞分化成熟作用具有劑量依賴性。

本實驗RT-PCR法顯示RAW264.7細胞未受誘導時就表達破骨細胞表型基因TRAP與骨吸收功能相關基因cathepsin K。30% RPMI 8226細胞條件培養液能刺激RAW264.7細胞上調TRAP和cathepsin K mRNA表達，與rhRANKL和MG-63細胞對照組相似。1 mg/L 人抑制性RANKL單克隆抗體抑制30% RPMI 8226細胞條件培養液組TRAP mRNA表達低于無抗體組，這與TRAP染色實驗中該干預組誘導TRAP陽性破骨細胞減少的結果一致。但cathepsin K mRNA受人抑制性RANKL單克隆抗體抑制作用不明顯。

本實驗證實了多發性骨髓瘤RPMI 8226細胞條件培養液中所含的sRANKL具有促使RAW264.7細胞分化成TRAP陽性多核成熟破骨細胞的生物活性，且人抑制性RANKL單克隆抗體阻斷30%RPMI 8226細胞條件培養液中sRANKL的誘導分化作用具有濃度依賴性。這一發現將為探索多發性骨髓瘤骨病的分子機理以及尋找治療新靶點提供理論依據和實驗基礎，為廣大骨髓瘤患者造福。

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EffectofconditionedmediumofhumanmultiplemyelomaRPMI8226cellsonosteoclastogenesisofRAW264.7cells

TANG Li-yuan1, XU Yu2, CHEN Jin2, LIU Xin-hua3, YU Kang1

(1DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege;2WenzhouMedicalCollege,3HematologicMalignanciesandTransplantationImmunityResearchCenterofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:yukang62@126.com)

AIM: To investigate the osteoclastogenic effect of conditioned medium of human multiple myeloma RPMI 8226 cells on preosteoclast RAW264.7 cells.METHODSThe protein expression of soluble receptor activator of NF-κB ligand (sRANKL) was detected by Western blotting. The morphological changes of RAW264.7 cells were observed after tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining. The mRNA expression of TRAP and cathepsin K was evaluated by RT-PCR.RESULTSThe result of Western blotting showed that conditioned medium of RPMI 8226 cells contained sRANKL. RPMI 8226 cell conditioned medium induced RAW264.7 cells to differentiate into TRAP-positive multinuclear osteoclasts. Human neutralized RANKL monoclonal antibody suppressed the differentiation of preosteoclasts in a dose-dependent manner, which was induced by 30% RPMI 8226 cell conditioned medium. RPMI 8226 cell conditioned medium increased the mRNA expression of TRAP and cathepsin K in RAW264.7 cells.CONCLUSIONThe sRANKL in conditioned medium of human multiple myeloma RPMI 8226 cells has the bioactivity to induce preosteoclast RAW264.7 cells to differentiate into TRAP-positive multinuclear osteoclasts. Human neutralized RANKL monoclonal antibody suppresses the differentiation of preosteoclasts induced by sRANKL in a dose-dependent manner.

Multiple myeloma; Osteoclast; Receptor activator of NF-κB ligand

R733.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.013