肝癌Hep3B細(xì)胞HLA－G過(guò)表達(dá)對(duì)NK細(xì)胞體外殺傷作用的影響*

曾憲成， 張 彤， 李 華， 方天翎， 聶常富， 陳規(guī)劃△

(1增城市人民醫(yī)院普通外科，廣東增城511300;2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝移植中心，廣東廣州510630;3廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510120;4鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，河南鄭州450003)

人類(lèi)白細(xì)胞抗原G(human leukocyte antigen－G，HLA－G)是一種非經(jīng)典的HLA－Ib類(lèi)抗原，參與保護(hù)胚胎免受母體淋巴系統(tǒng)的攻擊。它最早于1987年被 Geraghty等［1］克隆，1990 年 Kovats等［2］發(fā)現(xiàn)它在胎盤(pán)絨毛遠(yuǎn)端的細(xì)胞滋養(yǎng)層特異表達(dá)。到目前為止已發(fā)現(xiàn)HLA－G在人類(lèi)多種惡性腫瘤中表達(dá)，HLA－G與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系成為關(guān)注的焦點(diǎn)。Wang等［3］發(fā)現(xiàn)肝癌中表達(dá)HLA－G，并且其是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，推測(cè)HLA－G可能通過(guò)抑制NK細(xì)胞，促進(jìn)肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞系中Hep3B細(xì)胞表達(dá)HLA－G最少，因此，我們選用Hep3B細(xì)胞構(gòu)建HLA－G過(guò)表達(dá)模型，研究其在體外與NK細(xì)胞殺傷作用的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

Hep3B細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所，采用含10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每3～4 d換液，70%～80%融合后0.25%胰蛋白酶消化傳代。大腸桿菌DH5α由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清及DMEM高糖培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco，dNTPs(Promega)，Taq polymerase(TaKaRa)，Plasmid Maxi Kit(Qiagen)，Xho I、Bam H I、Age I、T4 DNA ligase 和T4 DNA ligase buffer(NEB)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，Opti－MEM(Gibco)，RNAprep pure總 RNA提取試劑盒(北京天根)，快速凝膠回收試劑盒(O-mega)，SYBR? PrimeScriptTMRT－PCR Kit(TaKa-Ra)，小鼠抗人HLA－G單克隆抗體和小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(Abcam)，小鼠抗人HLA－ABC單克隆抗體(Biolegend)，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(Pierce)。

2 方法

2．1 引物設(shè)計(jì)和目的基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank HLA－G的編碼序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)包括HLA－G全長(zhǎng)的引物，HLA－G上游引物5’－TAATAACTCGAGATATGGTGGTCATGGCA－3’，下游引物5’－TAATAAGGATCCCTAATCTGAGCTCTTCTTCC －3’，擴(kuò)增片段為1 017 bp，引物由上海英駿公司合成。以含有待擴(kuò)增序列的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μL反應(yīng)總體積中加入下列物質(zhì):H2O 38 μL、10 × Pfx Buffer、10 mmol/L dNTPs 1.5 μL、50 mmol/L MgSO4、Platinum Pfx、10 mmol/L 引物各 1.5 μL，在PCR儀上完成PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下:95℃ 預(yù)變性2 min，95 ℃ 15 s，52 ℃ 15 s，68 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)，68℃ 5 min。取3.5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2．2 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將上述DNA片段退火，用T4連接酶連接于經(jīng)雙酶切(Xho I和Bam H I)的質(zhì)粒 pEGFP－C1，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，接種到含50 mg/L kanamycin的 LB培養(yǎng)基中。使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用Xho I和Bam H I分別酶切鑒定。將篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2．3 細(xì)胞培養(yǎng)與篩選 Hep3B細(xì)胞37℃、5%CO2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于12孔板中，至細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，加入含 G418的培養(yǎng)液1 mL/well(G418終濃度分別為100～800 mg/L)。持續(xù)培養(yǎng)，2周后G418濃度≤200 mg/L各孔細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)，而≥300 mg/L細(xì)胞孔相繼全部死亡。因此，在本實(shí)驗(yàn)條件下G418篩選濃度為400 mg/L，維持濃度為200 mg/L。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(無(wú)干預(yù)措施，Hep3B組)、空載體對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，Hep3B－GFP組)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pEGFP－C1－HLA－G質(zhì)粒，Hep3B－HLA－G組)。

2．4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選 2×105～3×105Hep3B細(xì)胞傳入24孔板，第2 d待細(xì)胞密度達(dá)70% ～85%以上時(shí)，按Lipofectamine 2000操作手冊(cè)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞用胰酶消化，按每孔50個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板。G418的篩選濃度維持2周后，擴(kuò)大培養(yǎng)。

2．5 Real－time PCR檢測(cè) HLA－G mRNA表達(dá)收集上述3組細(xì)胞，用PBS洗3次，按照試劑盒操作手冊(cè)提取總RNA，用紫外分光光度法定量RNA。將等量的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈。SYBR? Pri-meScriptTMRT－PCR Kit(兩步法)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:37℃ 15 min，85℃ 5 s。將PCR反應(yīng)液加入real－time PCR用反應(yīng)管中:95℃ 10 s，1個(gè)循環(huán);95℃5 s，60 ℃ 31 s，40 個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 10 s，95℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。分析熔解曲線和擴(kuò)增曲線，計(jì)算ΔCt值和 RQ 值(RQ=2－ΔΔCt)。

2．6 Western blotting檢測(cè)HLA－G蛋白表達(dá) 分別收取3組細(xì)胞，PBS洗3次，細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，按照試劑盒操作手冊(cè)提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒對(duì)收取的各組蛋白進(jìn)行定量，取等量蛋白30μg行SDS－PAGE，電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉3 h后加小鼠抗人單抗HLA－G I抗(1∶500)放置于4℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG II抗(1∶100 000)與膜室溫孵育1 h。PVDF膜曝光60～90 s后膠片放入全自動(dòng)X片沖洗機(jī)完成顯影、定影，干燥等。Bio－Rad全自動(dòng)掃描儀掃描膠片，Quantity One軟件分析結(jié)果。

2．7 細(xì)胞毒性檢測(cè) (1)實(shí)驗(yàn)分組為空白組、靶對(duì)照組、效應(yīng)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。(2)實(shí)驗(yàn)組包括未封閉組和封閉組。封閉組:選生長(zhǎng)良好的Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B－HLA－G細(xì)胞，每瓶均加入小鼠抗人 HLA －ABC 抗體(終濃度5 mg/L)［4］，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。未封閉組:為正常培養(yǎng)Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B－HLA－G細(xì)胞，未用小鼠抗人HLA－ABC抗體封閉。外周血單個(gè)核細(xì)胞的活性檢測(cè)法參照孫衛(wèi)民等［5］的方法計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整靶細(xì)胞濃度為1×108/L，效應(yīng)細(xì)胞濃度為1×109/L，效靶比(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞)10∶1。每組均各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。(3)計(jì)算方法:殺瘤活性(%)=1－(效應(yīng)組－對(duì)照組)/(靶對(duì)照組－空白對(duì)照組)×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PCR擴(kuò)增目的基因

PCR擴(kuò)增目的基因產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1 017 bp處有一特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期的大小片段一致，見(jiàn)圖1。

2 HLA－G過(guò)表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定

將pEGFP－C1－HLA－G進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，并與表達(dá)載體連接。對(duì)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的克隆抽提質(zhì)粒DNA。PCR產(chǎn)物得到了1 017 bp的目的片段和約4 731 bp的載體片段，結(jié)果表明HLA－G成功地構(gòu)建到pEGFP－C1表達(dá)載體中，見(jiàn)圖2。

Figure 1．Identification of PCR product of HLA－G gene by agarose gel electrophoresis．1，2:PCR product of HLA － G gene;3:marker．圖1 HLA－G基因PCR產(chǎn)物鑒定電泳圖

Figure 2．Agarose gel electrophoretic profile of recombinant expression plasmids digested by restrict endonucleases．1:the pEGFP－C1 plasmid digestion by Bam H I and Xho I(4 731 bp);2～7:the pEGFP－C1－HLA－G plasmid digested by Bam H I and Xho I(pEGFP－C1 is 4 731 bp and HLA－G is 1 017 bp);8:the pEGFP－C1－HLA－G plasmid without digestion(5 748 bp);9:marker．圖2 p EGFP－C1－HLA－G質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖

3 HLA－G過(guò)表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序鑒定

對(duì)初步鑒定為陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明:插入片段與設(shè)計(jì)的HLA－G核苷酸序列完全一致，插入序列方向、位置及大小均正確，未發(fā)現(xiàn)有突變、缺失、插入等異常存在，表明已經(jīng)成功地構(gòu)建針對(duì)HLA－G基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，見(jiàn)圖3。

4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染24 h后即有綠色熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染48 h后表達(dá)效率最高。經(jīng)G418篩選濃度維持2周后，挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞系。熒光顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光，提示獲得了穩(wěn)定表達(dá) HLA－G的Hep3B細(xì)胞系，見(jiàn)圖4。

Figure 3．Sequencing result of pEGFP－C1－HLA－G plasmid．圖3 pEGFP－C1－HLA－G質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果

Figure 4．Fluorescence microscope detection showed that pEGFP－C1 and pEGFP－C1－HLA－G were stably transfected into Hep3B cells(×100)．A:Hep3BGFP(phase－contrast);B:Hep3B－GFP(fluorescence);C:Hep3B－HLA－G(phase－contrast);D:Hep3B－HLA－G(fluorescence)．圖4 熒光顯微鏡檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP－C1和pEGFPC1－HLA－G的Hep3B細(xì)胞

5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞后HLA－G mRNA的表達(dá)

Real－time PCR檢測(cè) Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B－HLA－G各組 ΔCt值分別為0.00003±0.00000、0.00002±0.00000和0.00542±0.00149。其中Hep3B和Hep3B－GFP兩組RQ值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Hep3B－HLA－G組與前兩組相比，RQ值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，mRNA水平表達(dá)上調(diào)約180倍，見(jiàn)圖5。

6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞HLA－G蛋白的表達(dá)

Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B －HLA－G各組Western blotting結(jié)果顯示，HLA－G/β－actin吸光度比值分別為0.5698±0.1648、0.4748±0.1538和6.1188±0.1199，其中Hep3B和Hep3B－GFP兩組吸光度比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Hep3B－HLA－G與前兩組相比，吸光度比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，蛋白水平HLA－G表達(dá)上調(diào)約10倍，見(jiàn)圖6。

Figure 5．The mRNA expression of HLA －G detected by realtime PCR．ˉx±s．n=3．＊＊P＜0.01 vs Hep3B and Hep3B －GFP．圖5 Real－time PCR檢測(cè)各組HLA－G mRNA水平的變化

7 NK細(xì)胞殺傷活性的測(cè)定

NK細(xì)胞對(duì) Hep3B、Hep3B－GFP和 Hep3BHLA－G細(xì)胞的殺傷率見(jiàn)圖7。未封閉HLA－ABC靶位點(diǎn)時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)Hep3B組和Hep3B－GFP組殺傷率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與前兩組相比，NK細(xì)胞對(duì)Hep3B－HLA－G組的殺傷明顯下降(P＜0.01)。封閉HLA－ABC靶位點(diǎn)后，NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷較前均明顯增加(P＜0.01)，NK細(xì)胞對(duì)Hep3B(封閉)組和Hep3B－GFP(封閉)組的殺傷率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與前兩組相比，NK細(xì)胞對(duì)Hep3B－HLA－G(封閉)組的殺傷明顯下降(P＜0.01)。

討 論

Figure 6．The relative protein expression of HLA－G detected by Western blotting．ˉx±s．n=3．＊＊P＜0.01 vs Hep3B and Hep3B－GFP．圖6 Western blotting檢測(cè)各組HLA－G蛋白的表達(dá)

Figure 7．In vitro cell－killing effect of NK cells on Hep3B cells in different groups．ˉx±s．n=6．＊＊P＜0.01 vs Hep3B and Hep3B－GFP;△△P＜0.01 vs Hep3BHLA－G;##P＜0.01 vs Hep3B(block)and Hep3B－GFP(block)．圖7 NK細(xì)胞對(duì)不同處理組肝癌Hep3B細(xì)胞的殺傷作用

HLA－G定位于6號(hào)染色體短臂HLA遠(yuǎn)端300 bp以?xún)?nèi)，其由膜結(jié)合性重鏈和信號(hào)肽以非共價(jià)形式結(jié)合，重鏈需要與β2微球蛋白(β2－microglobulin，β2M)聯(lián)合才能與HLA－G配體結(jié)合［3］，并發(fā)揮生物作用。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，膜結(jié)合性重鏈包含3種免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(α1～α3)，其中α1和α2結(jié)構(gòu)域由數(shù)個(gè)肽結(jié)合區(qū)組成。由于有限的基因多態(tài)性，到目前為止，從胎盤(pán)源生HLA－G分子中僅分離鑒定出3種肽分子［6－7］。HLA－G具有抑制免疫細(xì)胞的功能，其能抑制NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞裂解以及T細(xì)胞增殖反應(yīng)［8］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到HLA－G，它在腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)同樣被認(rèn)為可能是腫瘤細(xì)胞得以逃避宿主免疫監(jiān)視的手段［9－11］。

本研究經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，表明插入片段與設(shè)計(jì)相符，成功構(gòu)建pEGFP－C1－HLAG過(guò)表達(dá)載體。通過(guò)Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到肝癌Hep3B細(xì)胞，24 h后即有綠色熒光蛋白的表達(dá)，48 h后最強(qiáng)，經(jīng)過(guò)G418篩選，成功建立穩(wěn)定表達(dá)HLA－G的肝癌Hep3B細(xì)胞株。經(jīng)real－time PCR檢測(cè)證實(shí)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Hep3B－HLA－G組HLA－G mRNA水平上調(diào)約180倍，差異顯著(P＜0.01)。通過(guò) Western blotting檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Hep3B－HLA－G組HLA－G蛋白表達(dá)上調(diào)約10倍，顯著差異(P＜0.01)。目地基因在mRNA及蛋白水平上調(diào)并不一致，在以往文獻(xiàn)中也有類(lèi)似報(bào)道［12］，我們推測(cè)可能的原因有:(1)pEGFP－C1表達(dá)載體采用CMV啟動(dòng)子，可以高效促進(jìn)外源性HLA－G基因轉(zhuǎn)錄;(2)HLA－G蛋白表達(dá)可能受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響，蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)修飾、折疊、磷酸化及脫磷酸化都影響其抗原性，針對(duì)同一種蛋白質(zhì)的不同抗原形式，需要不同的抗體檢測(cè)。與NK細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察到NK細(xì)胞對(duì)HLA－G過(guò)表達(dá)細(xì)胞細(xì)胞殺傷作用顯著減弱，進(jìn)一步說(shuō)明HLA－G可能是肝癌免疫逃逸的重要機(jī)制之一，HLA－G上調(diào)表達(dá)可以削弱NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞主要通過(guò)“丟失自我”機(jī)制啟動(dòng)殺瘤效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞在丟失或變構(gòu)HLA－A、HLA－B和HLA－C的同時(shí)可高表達(dá)非經(jīng)典MHC－Ⅰ類(lèi)分子(如 HLA－G、HLA－E)，傳遞強(qiáng)烈的殺傷抑制信號(hào)，致使腫瘤細(xì)胞在逃逸細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)的殺傷作用后又逃逸NK細(xì)胞的殺傷作用。這在我們的研究中得到證實(shí)，抗體封閉肝癌Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3BHLA－G細(xì)胞HLA－ABC靶位點(diǎn)時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)其殺傷均明顯增強(qiáng)。這提示當(dāng)靶細(xì)胞表面經(jīng)典MHC－Ⅰ類(lèi)分子表達(dá)下調(diào)后，NK細(xì)胞才能啟動(dòng)對(duì)其殺傷。我們?cè)贖LA－E基因觀察到了相似的結(jié)果［13］，其確切機(jī)制目前尚不明確。我們推測(cè)，抗體封閉了靶細(xì)胞表面經(jīng)典MHC－Ⅰ類(lèi)分子，使NK細(xì)胞的部分殺傷抑制性受體不能識(shí)別其配體而阻斷了負(fù)性信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致了NK細(xì)胞對(duì)這些靶細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，HLA－G可與以下ILT－2、ILT －4、KIR2DL4 等［14－15］受體結(jié)合，向 NK 細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)，但究竟通過(guò)何種途徑引發(fā)一系列下游事件，從而使得NK細(xì)胞發(fā)生改變，仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建HLA－G過(guò)表達(dá)載體，特異性上調(diào)HLA－G表達(dá)，成功建立HLA－G過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，并證實(shí)HLA－G可以削弱NK細(xì)胞免疫監(jiān)視功能，為進(jìn)一步研究HLA－G的功能及其在肝癌免疫逃逸中的作用及機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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