肌球蛋白輕鏈激酶在失血性休克大鼠離體淋巴管收縮性雙相變化中的作用*

張玉平， 牛春雨， 趙自剛， 秦立鵬， 司永華， 張立民， 張 靜

(河北北方學院微循環研究所，基礎醫學院病理生理學教研室，河北 張家口 075000)

1000-4718(2012)04-0589-06

2011-10-08

2012-02-29

國家自然科學基金資助項目(No.30770845)；河北省自然科學基金資助項目(No.C2008000503)；河北省教育廳科學研究重點項目(No.ZH2007101);河北省百名優秀人才支持計劃(No.CPRC047)

△通訊作者 Tel:0313-4029168；E-mail：ncylxf@126.com

肌球蛋白輕鏈激酶在失血性休克大鼠離體淋巴管收縮性雙相變化中的作用*

張玉平， 牛春雨△， 趙自剛， 秦立鵬， 司永華， 張立民， 張 靜

(河北北方學院微循環研究所，基礎醫學院病理生理學教研室，河北 張家口 075000)

目的探討肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)在失血性休克(HS)大鼠離體淋巴管收縮性雙相變化中的作用機制。方法Wistar雄性大鼠隨機均分為對照組和HS組(復制HS模型，分為HS 0 h、0.5 h、1 h、2 h和3 h亞組)，留取胸導管組織，檢測磷酸化MLCK(p-MLCK)含量；制備對照、HS 0.5 h與2 h組的淋巴管條，采用離體淋巴管收縮性觀察技術，觀察MLCK抑制劑ML-7和激動劑P物質(SP)對HS 0.5 h及2 h淋巴管收縮頻率(CF)、收縮末期直徑、舒張末期直徑和被動直徑的影響，計算淋巴管緊張性指數(TI)、收縮幅度(CA)和泵流分數(FPF)，評價淋巴管收縮性。結果HS 0 h和0.5 h淋巴管組織p-MLCK蛋白顯著高于對照組；隨著休克發展，p-MLCK含量逐漸降低。在1、3、5 cmH2O等多個跨壁壓下，HS 0.5 h組淋巴管的CF、TI和FPF均顯著高于對照組，ML-7可顯著下調這些指標，SP則可明顯降低ML-7的作用，使之恢復至HS 0.5 h水平；HS 0.5 h組淋巴管的CF、TI和FPF均顯著低于對照組，SP可顯著上調這些指標，ML-7則可顯著降低SP的作用。HS 0.5 h與2 h離體淋巴管CA與對照組相比無顯著變化，SP可降低HS 2 h淋巴管的CA，ML-7可抑制該作用，但二者對HS 0.5 h無明顯作用。結論MLCK作為影響淋巴管平滑肌細胞收縮的關鍵酶，參與了HS發展進程中淋巴管收縮性的雙相調節。

休克，出血性； 淋巴管； 收縮性； 肌球蛋白輕鏈激酶

研究發現，在失血性休克(hemorrhagic shock，HS)發展進程中存在淋巴微循環障礙，表現為淋巴管收縮性降低[1-2]，且淋巴微循環狀況影響休克的轉歸[3-4]，因此淋巴管收縮功能與休克的發展密切相關[5]；進一步發現淋巴管收縮受交感神經[6]、降鈣素基因相關肽[7]等體液因子調控；為了排除神經、體液因素對淋巴管收縮性的影響，獨立研究休克發展過程中淋巴管本身收縮性的變化，參照文獻[8]的研究方法，我們建立了休克離體淋巴管收縮性觀察技術平臺，發現在休克不同發展過程中淋巴管收縮性表現為雙相變化，即休克早期淋巴管收縮性增強(休克即刻、休克0.5 h)、重癥休克期淋巴管收縮性降低(休克2 h、休克3 h)[9]，P物質(substance P，SP)也具有增強休克離體淋巴管泵功能的作用[10]。研究表明，淋巴管平滑肌細胞(lymphatic smooth muscle cells，LSMC)外的鈣離子進入細胞內引起細胞內鈣離子濃度升高，活化鈣調蛋白，與鈣離子結合后，與肌球蛋白輕鏈激酶(myosin-light-chain kinase，MLCK)結合從而活化MLCK，引起20 kD肌球蛋白輕鏈(20 kD myosin light chain，MLC20)磷酸化，最終導致LSMC收縮，引起淋巴管收縮，可見MLCK是淋巴管收縮的關鍵酶[11]。那么，在休克淋巴管收縮性雙相變化過程中，LSMC中MLCK活性有何變化？MLCK是否參與淋巴管收縮性的變化？為此，本研究測定了休克發展過程中磷酸化MLCK(p-MLCK)水平的變化，采用微血管壓力-直徑肌動儀觀察MLCK對離體淋巴管泵活性的影響，探討MLCK在休克淋巴管收縮性雙相變化中的作用。

材 料 和 方 法

1主要試劑、實驗動物與分組

MLCK特異性抑制劑ML-7、激動劑SP購自Enzo，p-MLCK的ELISA試劑盒購自江蘇希望生物科技有限公司(抗體由R&D生產)；SPF級雄性Wistar大鼠123只，體重250～330 g，購自中國軍事醫學科學院動物繁殖中心，所有動物實驗前自由飲水、禁食12 h。其中，72只動物隨機均分為對照組(control)、HS 0 h組、HS 0.5 h組、HS 1 h組、HS 2 h組和HS 3 h組，用于留取淋巴管組織；51只動物隨機分為control組(n=8)、HS 0.5 h組(n=8)、HS 0.5 h+ML-7組(n=7)、HS 0.5 h+ ML-7+SP組(n=7)、HS 2 h組(n=8)、HS 2 h+SP組(n=6)和HS 2 h+SP+ML-7(n=7)，用于制備離體淋巴管條。

2失血性休克模型復制

大鼠經1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)肌肉注射麻醉后，行股部手術。分離左側股靜脈和股動脈，股靜脈注射肝素鈉(500 U/kg)抗凝，股動脈插管并通過RM6240BD 型生物信號采集處理系統(成都儀器廠)監測平均動脈血壓(mean artery pressure，MAP)；同時，分離右側動脈，插管備放血用。手術完成后，穩定30 min，經右股動脈使用NE-1000型程控微量注射泵(New Era Pump Systems)緩慢勻速放血，10 min 內至MAP 40 mmHg，實驗中通過失血量的調整維持MAP在(40±2)mmHg水平，復制HS模型。

3淋巴管組織的留取與p-MLCK含量檢測

對照組在完成所有手術穩定30 min后、HS各組大鼠在相應時點，腹腔注射1%戊巴比妥鈉120 mg/kg后，側切口打開胸壁，切除胸骨及與其相連的約一半肋骨，靠近膈肌結扎并切斷下腔靜脈。將心、肺推向身體左側，暴露胸主動脈和脊柱之間包含胸導管的組織，緊貼脊柱迅速剪取長3～4 cm包含胸導管的組織，移入盛有0～4 ℃、通氣(95%O2、5%CO2)的冷PSS緩沖液(mmol/L：NaCl 118.99、KCl 4.69、CaCl22.50、MgSO41.17、KH2PO41.18、NaHCO325.0、EDTA·Na20.03、葡萄糖 5.50)的培養皿中。SSZ型手術顯微鏡(上海光學儀器廠)下分離、去除胸導管周圍的脂肪組織，留取淋巴管組織，置于-70 ℃冰柜中保存。

取出每組12條淋巴管，隨機分為6亞組(6個重復)，即每亞組2條淋巴管，移入EP管后，用顯微手術器械在冰浴上剪碎后，加入組織細胞裂解液，超聲波細胞破碎儀破碎組織15 min后，應用低溫高速離心機在4 ℃、14 000×g離心5 min，保存上清。應用p-MLCK蛋白ELISA檢測試劑盒，應用標準品繪制標準曲線(p-MLCK=0.05697x+0.0051x2+0.000157x3，R2=0.998)后，檢測各組淋巴管組織p-MLCK蛋白含量。淋巴管組織勻漿蛋白以考馬斯亮藍法定量。

4離體淋巴管的制備、固定、孵育與收縮性觀察

按前述方法留取淋巴管組織、去除周圍脂肪組織后，按我室常規方法[9-10,12]制備離體淋巴管條，移入微血管壓力-直徑測定儀浴槽內，固定于毛細玻璃管上，通過壓力伺服系統(Living Systems Instrumentation PS/20)控制管腔內壓力(3 cmH2O)，保證淋巴管壁無滲漏、無損傷和扭轉，進行升溫、孵育，直至淋巴管出現自發性收縮后，進行淋巴管收縮性觀察。

調節壓力伺服系統使淋巴管跨壁壓分別維持在1、3和5 cmH2O下，記錄control、HS 0.5 h和HS 2 h組淋巴管的收縮頻率(contraction frequency，CF)、舒張末期直徑和收縮末期直徑；HS 0.5 h+ML-7、HS 0.5 h+ML-7+SP、HS 2 h+SP和HS 2 h+SP+ML-7組，在浴槽內分別加入ML-7(10-5mmol/L)、ML-7(10-5mmol/L)+SP(10-7mmol/L)、SP(10-7mmol/L)和SP(10-7mmol/L)+ML-7(10-5mmol/L)孵育10 min后檢測相關指標；待各組實驗結束之后，測得相應壓力下淋巴管的最大被動舒張直徑[10, 13]，計算緊張指數(tonic index，TI)、收縮幅度(contraction amplitude，CA)和泵流分數(fractional pump flow，FPF)，結合CF評價淋巴管收縮性(參見文獻[9-10，12-13])。

5統計學處理

結 果

1失血性休克發展過程中淋巴管組織p-MLCK蛋白含量的變化

如圖1示，與對照組比較，HS 0 h和0.5 h淋巴管組織MLCK蛋白顯著增高(P<0.05，P<0.01)；隨著休克發展，MLCK蛋白表達逐漸降低，表現為HS 1 h、HS 2 h和HS 3 h顯著低于HS 0 h和HS 0.5 h(P<0.01)。

2MLCK對休克淋巴管緊張性指數的影響

與對照組比較，HS 0.5 h組淋巴管在1、3和5 cmH2O跨壁壓下的緊張性指數增高，HS 2 h組淋巴管在1、3 cmH2O跨壁壓下的緊張性指數降低；與MLCK特異性抑制劑ML-7孵育的HS 0.5 h+ML-7組淋巴管在各跨壁壓下的緊張性指數均顯著低于HS 0.5 h組，而再與MLCK激動劑SP孵育后的HS 0.5 h+ML-7+SP組淋巴管在3、5 cmH2O跨壁壓下的緊張性指數顯著增高，高于HS 0.5 h+ML-7組；HS 2 h組與SP孵育后，淋巴管緊張性指數在各跨壁壓下均顯著高于HS 2 h組，HS 2 h組淋巴管與SP孵育后再與ML-7孵育，其緊張性指數顯著降低，在各跨壁壓下均顯著低于HS 2h+SP組，而與HS 2 h組相比無顯著差異，見圖2。

3MLCK對休克淋巴管收縮頻率的影響

由圖3可見，HS 0.5 h組淋巴管在1、3和5 cmH2O跨壁壓下的CF均顯著高于、HS 2 h組淋巴管在各跨壁壓下均顯著低于對照組；與ML-7孵育后，HS 0.5 h+ML-7組淋巴管在各跨壁壓下的CF均顯著低于HS 0.5 h組，再與SP孵育后的HS 0.5 h+ML-7+SP組淋巴管在各跨壁壓下，CF均得到回升，高于HS 0.5 h+ML-7組；HS 2 h組與SP孵育后，淋巴管CF在各跨壁壓下均顯著高于HS 2 h組，再與ML-7孵育后的HS 2 h+SP+ML-7組的淋巴管CF在各跨壁壓下均顯著低于HS 2 h+SP組，而與HS 2 h組差異無統計學意義。

4MLCK對休克淋巴管收縮幅度的影響

由圖4可見，HS 0.5 h與HS 2 h組淋巴管在各跨壁壓下的CA均與對照組無顯著差異；HS 0.5 h組淋巴管分別與ML-7或ML-7+SP孵育后，CA亦未見顯著變化。HS 2 h組淋巴管與SP孵育后，其CA值在1、3 cmH2O跨壁壓下顯著下降，低于對照組與HS 2 h組；再與ML-7孵育后的HS 2 h+SP+ML-7組淋巴管CA值顯著高于HS 2 h+SP組。

圖1失血性休克發展過程中淋巴管組織p-MLCK蛋白的水平

圖2ML-7和(或)SP對休克大鼠離體淋巴管緊張性指數的影響

圖3ML-7和(或)SP對休克大鼠離體淋巴管收縮頻率的影響

圖4ML-7和(或)SP對休克大鼠離體淋巴管收縮幅度的影響

5MLCK對休克淋巴管泵流分數的影響

在各跨壁壓下，HS 0.5 h組淋巴管的FPF均顯著高于對照組，與ML-7孵育后，HS 0.5 h+ML-7組淋巴管的FPF均顯著低于HS 0.5 h組，再與SP孵育后的HS 0.5 h+ML-7+SP組淋巴管FPF均顯著高于HS 0.5 h+ML-7組，恢復到HS 0.5 h水平；HS 2 h組淋巴管的FPF均顯著低于對照組，與SP孵育后，FPF顯著增高，而再與ML-7孵育后的HS 2 h+SP+ML-7組淋巴管FPF均下降至HS 2 h組水平，均顯著低于HS 2 h+SP組，見圖5。

圖5ML-7和(或)SP對休克大鼠離體淋巴管泵流分數的影響

討 論

本研究運用微血管壓力-直徑測定系統體外檢測休克不同時程淋巴管在1、3和5 cmH2O跨壁壓下內源性泵活性的變化。實驗中采用4個指標評價淋巴管的功能狀態：緊張性指數反映淋巴管緊張性收縮狀態，為淋巴管時相性收縮的準備狀態，受神經、體液、充盈和機械力等多種因素的影響；收縮頻率反映單位時間內淋巴管收縮的次數，是淋巴管時相性收縮指標；收縮幅度反映單次淋巴管舒縮的強度；泵流分數反映淋巴管每分鐘輸送淋巴液的能力，是一個全面衡量淋巴管泵功能活性的指標，緊張指數、收縮頻率和收縮幅度都可以引起泵流分數的變化。盡管本實驗已排除了神經-體液、滲透梯度、機械擠壓、淋巴液生成速率及流量等外源性驅動力對淋巴管收縮性的影響，但休克淋巴管緊張指數、收縮頻率和泵流分數等多個指標出現類似于休克血管的先增高后降低的雙相性變化[14- 15]，說明淋巴管本身的收縮物質也出現了某種變化。

研究表明，在淋巴管平滑肌細胞收縮過程中，細胞內增加的Ca2+，先結合于胞漿中的鈣調蛋白(calmodulin, CaM)，后者結合4個Ca2+之后活化MLCK，然后，MLCK磷酸化調節MLC20，從而激活肌球蛋白頭端的ATP酶活性，最終引起肌球蛋白和肌動蛋白相互作用，啟動平滑肌收縮。在MLC20磷酸化過程中涉及多種激酶的作用，其中，Ca2+-CaM-MLCK認為是最重要的途徑。許多研究顯示，MLCK引起的MLC20磷酸化是一個關鍵性的樞紐，不同的調節機制通過它來調節平滑肌的收縮行為。通過檢測淋巴管組織p-MLCK蛋白含量，發現在休克發展進程中，p-MLCK與淋巴管收縮性的雙相變化相一致，即在休克早期表達增多，后期降低。為了進一步觀察MLCK在淋巴管收縮雙相變化中的作用，實驗中我們選取休克0.5 h和2 h時點，初步觀察了Ca2+-CaM-MLCK途徑激動劑SP[8, 16]和MLCK特異性抑制劑ML-7[8]對失血性休克淋巴管收縮性的影響。結果發現，休克0.5 h離體淋巴管顯著增高的緊張指數、收縮頻率和泵流分數被ML-7明顯抑制，SP可顯著改善ML-7對休克0.5 h離體淋巴管上述指標的抑制作用，但休克0.5 h離體淋巴管的收縮幅度未受ML-7和SP的影響；休克2 h離體淋巴管顯著降低的緊張指數、收縮頻率和泵流分數被SP改善，同樣，ML-7也顯著抑制了SP對上述指標的提升效應。這些數據表明，失血性休克淋巴管收縮的雙相性改變與MLCK密切相關。

值得注意的是，休克2 h離體淋巴管的收縮幅度在給予SP后的1和3 cmH2O壓力下明顯下降。除此之外，在整個實驗中，淋巴管收縮幅度隨著壓力的增加下降，休克各組、HS 0.5 h+ML-7組、HS 0.5 h+ML-7+SP組和HS 2 h+SP+ML-7組與對照之間無顯著差異。休克離體淋巴管收縮幅度的這種變化可能與淋巴管平滑肌舒縮機制的復雜性有關[17-20]。Wang等[8]研究表明，抑制淋巴管平滑肌MLC20磷酸化水平可抑制淋巴管的收縮活性，但是收縮幅度有效運行可能僅需要20%或更低水平的MLC20磷酸化就能夠完成；因此可以這樣解釋，休克過程中MLCK活性的改變引起了MLC20磷酸化水平的變化，出現緊張指數和收縮頻率的改變，但是這種改變還不至于影響到收縮幅度。給予SP后休克2 h組在1和3 cmH2O壓力下收縮幅度降低，可能是由于SP引起的收縮頻率顯著增加、壓縮了淋巴管的舒張時間，使其舒張不充分造成的[16]。

需要指出，本實驗所應用的ML-7為MLCK特異性抑制劑，可顯著抑制休克0.5 h淋巴管在不同跨壁壓下的收縮功能，同時又具有抑制SP提高休克2 h淋巴管收縮性的作用，盡管SP能促進MLCK的磷酸化及其對淋巴管的收縮，并非MLCK的特異性激動劑，也可說明MLCK參與了休克后淋巴管收縮性雙相變化的調節；當然還有待在以后的實驗中觀察其它與MLCK相關的特異性激動劑在休克后淋巴管收縮中的作用，以尋找更有利的證據。同時，我們在以前的研究中觀察到SP作為血管與淋巴管活性的調節物質具有收縮休克淋巴管的作用[10]，為本文應用SP這一收縮物質與ML-7作為對比、觀察MLCK對休克淋巴管的調節作用提供了實驗依據；當然在以后的研究中，我們還應考慮苯腎上腺素、5-羥色胺等其它收縮劑作為參考，以進一步明確休克淋巴管收縮性雙相變化的調節機制。

總之，MLCK作為MLC20磷酸化以及Ca2+-CaM-MLCK途徑的關鍵酶，在失血性休克后淋巴管收縮性的雙相變化中發揮重要作用，MLCK相關工具藥對休克淋巴管收縮性的調控作用為以淋巴管收縮為研究靶點調控淋巴障礙性疾病的干預治療提供了有效的實驗依據。同時，由于p-MLC20水平還取決于肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin-light-chain phosphatase,MLCP)對p-MLC20的去磷酸化作用，MLCK/MLCP共同調節MLC20磷酸化水平，引起淋巴管收縮性變化。因此，要闡明失血性休克發展過程中淋巴管收縮性變化的機制，還需進一步研究休克淋巴管MLCK、MLCP和p-MLC20水平的相互關系。

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Roleofmyosin-light-chainkinaseinbiphasiccontractileactivityoflymphaticsisolatedfromhemorrhagicshockrats

ZHANG Yu-ping, NIU Chun-yu, ZHAO Zi-gang, QIN Li-peng, SI Yong-hua, ZHANG Li-min, ZHANG Jing

(InstituteofMicrocirculation,DepartmentofPathophysiololgy,BasicMedicalCollege,HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China.E-mail:ncylxf@126.com)

AIM: To elucidate the mechanism by which myosin-light-chain kinase (MLCK) modulates the biphasic contractile activity of lymphatics isolated from the rats subject to hemorrhagic shock (HS).METHODSMale Wistar rats were randomiz to control group and HS group. In HS group, the rats were subject to HS and then further divided into HS 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h and 3 h subgroups. Thoracic ducts of control and shock rats were isolated and used to determine the protein levels of phosphorylated MLCK (p-MLCK). In addition, thoracic ducts obtained from control, 0.5 h- and 2 h-shocked rats were used to observe the contractile properties of lymphatics by a pressure myographinvitro. Lymphatic rings were prepared and incubated with ML-7 (a specific inhibitor of MLCK) or substance P (SP, an agonist of MLCK). During the experiment, the contractile frequency (CF), end-diastolic diameter, end-systolic diameter and passive diameter in Ca2+-free PSS buffer were measured and used to calculate the lymphatic tonic index (TI), contractile amplitude (CA) and fractional pump flow (FPF) as the indexes of lymphatic contraction activity.RESULTSThe levels of p-MLCK in lymphatics in 0 h- and 0.5 h-shocked rats were significantly increased compared with the control rats, and it was gradually decreased with the development of shock. The values of CF, TI and FPF in 0.5 h-shocked lymphatics were significantly increased at transmural pressure of 1, 3 and 5 cmH2O compared with those in control group, and significantly blunted by ML-7. SP obviously increased the suppressive effects induced by ML-7 and restored the values of CF, TI and FPF to the levels of HS 0.5 h group. CF, TI and FPF in 2 h-shocked lymphatics significantly declined under different transmural pressure as compared with those in control group, and significantly elevated by SP. Similarly, ML-7 depressed the effects of SP. No significant difference was found in CA between 0.5 h- and 2 h-shocked lymphatics. SP decreased the CA of lymphatics obtained from 2 h-shocked rats and this effect was suppressed by ML-7. However, both agents had no effects on CA of 0.5 h-shocked lymphatics.CONCLUSIONMLCK, as an essential enzyme that influences the contraction of lymphatic smooth muscle cells, involves in the modulation of biphasic changes of lymphatic contractile activity during the process of HS.

Shock,hemorrhagic; Lymphatics; Contractility; Myosin-light-chain kinase

R364.1+4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.003