Zacopride增強心肌內向整流鉀電流(IK1)效應的受體和信號轉導通路*

劉清華, 許言午， 吳博威

(山西醫科大學1病理生理教研室, 2生理教研室,3細胞生理學省部共建教育部重點實驗室, 山西 太原030001；4上海中醫藥大學生物化學教研室，上海 201200)

1000-4718(2012)01-0006-05

2011-05-23

2011-11-09

國家自然科學基金資助項目(No. 30840038);山西省自然科學基金青年項目(No. 2009021043-2)

△通訊作者 Tel: 0351-4135067; E-mail: liuqh20041206@163.com

Zacopride增強心肌內向整流鉀電流(IK1)效應的受體和信號轉導通路*

劉清華1,3△, 許言午4， 吳博威2,3

(山西醫科大學1病理生理教研室,2生理教研室,3細胞生理學省部共建教育部重點實驗室, 山西 太原030001；4上海中醫藥大學生物化學教研室，上海 201200)

目的探討5-HT4受體激動劑兼5-HT3受體阻斷劑zacopride增強心肌內向整流鉀電流(IK1)效應的受體和細胞信號轉導機制。方法應用全細胞膜片鉗技術記錄大鼠心室肌細胞膜IK1電流，分別觀察10 μmol/L 5-HT4受體阻斷劑 RS23597-190、10 μmol/L 5-HT3受體激動劑間氯苯雙胍(m-CPBG)、5 μmol/L PKA 抑制劑 KT5720、5 μmol/L PKC 抑制劑GF109203x 和 5 μmol/L PKG抑制劑 KT5823對zacopride 增強IK1的影響。結果10 μmol/L 5-HT4受體阻斷劑RS23597-190本身可抑制IK1電流，在預先應用RS23597-190的基礎上，1 μmol/L zacopride仍可明顯激動IK1通道，使其內向電流(-100 mV)增強32.5% (P< 0.05)。10 μmol/L 5-HT3受體激動劑m-CPBG對IK1電流無明顯影響，也不能逆轉1 μmol/L zacopride對IK1的增強效應(P> 0.05)。此外，5 μmol/L PKA 阻斷劑 KT5720能顯著抑制1 μmol/L zacopride對IK1的增強效應(P< 0.05)，而PKC 阻斷劑GF109203x和PKG阻斷劑KT5823則對1 μmol/L zacopride的效應無明顯影響(P> 0.05)。結論Zacopride對IK1的增強作用可能經由PKA介導的信號轉導通路，而不依賴于5-HT3和5-HT4受體。

內向整流鉀通道； Zacopride； 受體，5-HT

Zacopride屬苯甲酰胺衍生物，兼有5-羥色胺4(5-hydroxytryptamine 4,5-HT4)受體激動劑和5-羥色胺3(5-HT3)受體阻斷劑作用，對實驗動物具有促胃腸道動力和止吐作用[1-2]。我們在一項比較5-HT4受體激動劑致心律失常副作用的研究中發現 zacopride對正常大鼠心律和心功能均無明顯影響。Zacopride對大鼠心室肌內向整流鉀電流(inward rectifier K+current,IK1)表現出顯著的增強作用，同時對Ito、ICa-L、INa等影響動作電位的主要離子流均無顯著作用。IK1是心肌最主要的背景電流，參與靜息電位的維持和心肌動作電位3期終末的復極。Zacopride增強IK1可以使細胞膜超極化，增大靜息膜電位，并縮短動作電位時程，從而消除烏頭堿、氯化鋇中毒等因素引發的心律失常[3]。增強心室肌IK1有可能成為一條抗心律失常的新途徑。由于5-HT受體廣泛分布于中樞神經系統和外周組織，因此首先要明確zacopride增強IK1是經5-HT受體介導還是經受體外途徑，亦或兩者兼有。磷酸化是許多離子通道或轉運體信號通路調節的重要機制和環節，IK1也不例外。多年來對IK1影響因素的研究表明，IK1受到PLC/ Ca2+/PKC和AC/cAMP/PKA信號轉導系統的雙重調節[4-6]，而NO/cGMP/PKG信號系統對IK1的調節鮮有報道。Zacopride增強IK1的作用究竟受到何種信號系統的調節？本實驗將采用全細胞膜片鉗技術研究5-HT4受體阻斷劑 RS23597-190， 5-HT3受體激動劑間氯苯雙胍(m-chlorophenylbiguanide，m-CPBG)、PKA 抑制劑 KT5720、PKC 抑制劑GF109203x 和 PKG抑制劑 KT5823對zacopride增強IK1的影響，從而探討zacopride增強IK1的受體與細胞信號轉導機制。

材 料 和 方 法

1試劑及配制

1.1Zacopride hydrochloride、RS23597-190、m-CPBG、KT5720、GF109203x、KT5823和牛磺酸購自Tocris。膠原酶P購自德國Bochringer Mannhein。其余均為國內生產分析純產品。

1.2臺氏液(mmol/L) NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5.0，葡萄糖10，MgCl21.0，CaCl21.8，用NaOH調節pH至7.38。酶液為無鈣臺氏液中加入牛磺酸20，膠原酶70～100 mg/L。

1.3KB液(mmol/L) KOH 85，L-谷氨酸 50，KCl 30，牛磺酸 20，KH2PO430，MgCl21.0，HEPES 10，葡萄糖 10，EGTA 0.5，用KOH調節pH至7.4。

1.4IK1電極內液成分(mmol/L) KCl 150，HEPES 5，EGTA 5.0，ATP-K23.0，MgCl21.0，4-AP 5.0，ATP-Mg 1.0，用KOH調節pH至7.3；細胞外液在臺氏液中加入CdCl20.5 mmol/L阻斷ICa-L電流。

2分離單個心室肌細胞及記錄IK1電流

選用健康成年SD大鼠(購自河北實驗動物中心)，雄性，220～250 g，術前15 min靜脈注射肝素(1 000 U/kg)，戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉后頸動脈放血，迅速開胸取出心臟，置于4 ℃用100%氧氣飽和的無鈣臺氏液中修剪，然后將心臟懸掛在Langendorff灌流裝置上經主動脈逆行灌流。先用無鈣臺氏液灌流8～10 min，再用酶液循環灌流15～20 min。 灌流過程中保持37 ℃恒溫，灌流壓6.86 kPa，并持續通以100%氧氣。待心室肌組織變大、變軟后將其剪碎，置于KB 液中輕輕吹打得到分散的心室肌細胞，經150 μm孔徑的濾網過濾后保存于KB液中。室溫放置2～3 h后將存放于高鉀KB液中的細胞逐步復鈣。然后取幾滴細胞懸液加入細胞池(約1 mL)，平放在連有微操縱儀的倒置顯微鏡上靜置10 min，待細胞充分貼壁后，用臺氏液灌流，速度約2 mL/min。電極用玻璃毛細管經微電極拉制儀(Narishige，PP-83)分兩步拉制而成，充灌電極內液后，電阻約2～5 MΩ。選取橫紋清晰的心肌細胞進行實驗。形成高阻抗封接后，用負壓破膜，進行全細胞記錄。離子電流信號經Axopatch 200B膜片鉗放大器(Axon Instrument)、Digidate 1322A模數轉換器及Pclamp8.0采集、貯存及分析。所有實驗均在室溫25 ℃下進行。電壓鉗方式下進行全細胞離子流記錄。分別觀察1 μmol/L zacopride 對IK1的增強效應，及10 μmol/L 5-HT4受體阻斷劑 RS23597-190、10 μmol/L 5-HT3受體激動劑m-CPBG、5 μmol/L PKA 抑制劑 KT5720、5 μmol/L PKC 抑制劑GF109203x和5 μmol/L PKG抑制劑 KT5823對zacopride增強IK1的影響。

3統計學處理

結 果

1Zacopride增強IK1的受體通路

1.1Zacopride呈濃度依賴性增強IK1，1 μmol/L為其最適濃度[3]， 5-HT4受體阻斷劑RS23597-190(10 μmol/L)本身可抑制IK1，在此基礎上，應用1 μmol/L zacopride仍可顯著激動IK1通道，其內向電流(-100 mV)可增大32.5% [由(- 5.10 ± 0.46) pA/pF增大至(- 6.76 ± 0.60) pA/pF，P< 0.05]，表明 zacopride對IK1的增強效應不是由5-HT4受體介導的，見圖1。

圖15-HT4受體阻斷劑RS23597-190對zacopride增強IK1的影響

1.21 μmol/L zacopride可顯著增強IK1，10 μmol/L 5-HT3受體激動劑m-CPBG對IK1電流無明顯影響，也不能逆轉1 μmol/L zacopride對IK1的增強效應(P> 0.05)。表明 zacopride增強IK1不通過5-HT3受體途徑，見圖2。

圖25-HT3受體激動劑m-CPBG對zacopride增強IK1的影響

2Zacopride增強IK1的細胞信號轉導通路

2.15 μmol/L PKA阻斷劑 KT5720能完全逆轉1 μmol/L zacopride對IK1的增強效應(P< 0.05)，表明zacopride可能經由PKA信號系統增強IK1，見圖3、5。

圖3PKA阻斷劑KT5720對zacopride增強IK1的影響

2.25 μmol/L PKC阻斷劑GF109203x對1 μmol/L zacopride的效應無明顯影響(P>0.05)，提示PKC信號系統不參與zacopride對IK1的調節作用，見圖4、5。

圖4PKC阻斷劑GF109203x對zacopride增強IK1的影響

2.35 μmol/L PKG阻斷劑KT5823對1 μmol/L zacopride的效應無明顯影響(P> 0.05)，提示PKG信號系統也不參與zacopride對IK1的調節，見圖5。

討 論

5-HT受體廣泛分布于中樞神經系統和外周組織，對外周組織多種器官的反應起重要作用，包括消化道、膀胱、心臟和腎上腺，在中樞神經系統如認知、情感、食欲調節、止吐和抗焦慮等方面也具有重要的作用。5-HT4受體激動劑作為促胃腸動力藥可以促進胃排空、加快小腸和結腸蠕動[7]；而5-HT3受體目前只有阻斷劑具有臨床應用價值，用于止吐和腸易激綜合征[8]。但這些藥物在發揮相應效應的同時其致心律失常副作用也引起了普遍擔憂。已有的研究表明，5-HT4受體激動劑和5-HT3受體阻斷劑潛在的致心律失常風險與其阻斷延遲整流鉀電流(IK)有關[9-10]，使得復極延緩，QT間期延長，甚至發生致死性尖端扭轉型室性心動過速(torsades de pointes, TDP)。Zacopride兼有5-HT4受體激動劑和5-HT3受體阻斷劑作用，但在我們的研究中，zacppride對實驗大鼠無明顯致心律失常副作用，且具有抗心律失常的療效，其離子機制為增強心室肌IK1，進而增大靜息膜電位，加快動作電位3期復極[3]。 Zacopride對IK1的特異性作用是否通過5-HT受體介導？這類藥物是否都具有相似的藥理學作用？我們分別觀察了5-HT4受體阻斷劑 RS23597-190和5-HT3受體激動劑m-CPBG 對zacopride增強IK1的影響，發現兩者均不能阻斷zacopride對大鼠心室肌IK1的增強效應。劉清華等[11]報道另一5-HT4受體激動劑兼5-HT3受體阻斷劑2-[1-(4-piperonyl)piperazinyl]benzothiazole致大鼠心律失常風險的電生理學機制為抑制IK1。綜合本文結果，zacopride對IK1的增強作用很可能是其特有的，非5-HT受體依賴性的藥理學作用。能否將IK1作為篩選安全促胃腸動力藥和止吐藥的新指標，將是我們下一步工作的方向。此外，5-HT4受體主要分布在心房組織，在多種動物種屬中會介導心動過速和正性變力效應，提示內源性5-HT4受體激活在心律失常發生中起重要作用，會導致心房纖顫和猝死[12]。以往認為大鼠心室肌缺乏5-HT4受體[13]，而最近的研究顯示大鼠心室肌細胞有5-HT4受體mRNA表達，在心衰大鼠，其表達可上調4倍[14]。作為5-HT4受體激動劑，zacopride對心房的作用有待進一步研究；而其對大鼠心室肌細胞IK1的非受體依賴性激動效應，究竟是由于5-HT4受體缺如所致，抑或另有途徑，也需進一步闡明。

Figure 5. The effects of the inhibitors of PKA, PKC and PKG on the augmentedIK1induced by 1 μmol/L zacopride. Zaco:zacopride.*P< 0.05vscontrol;#P< 0.05vsZaco.

圖5PKA、PKC和PKG阻斷劑對zacopride增強IK1的影響

許多研究表明PLC/Ca2+/PKC和AC/cAMP/PKA信號系統在IK1調節中具有作用，但各家報道不一。如Fakler等[4]認為PKA 催化亞基可上調爪蟾卵母細胞IK1的表達，而PKC特異性激動劑可下調IK1。Koumi等[5]發現純化的PKA 催化亞基下調內源性IK1。在人心肌細胞，內皮素(ET-1)對IK1的抑制作用可被PKC抑制劑staurosporine阻斷，但PKA特異性抑制劑 KT5720對內皮素的作用無影響[6]。在我們的研究中，5 μmol/L KT5720可顯著抑制zacopride對大鼠心室肌細胞IK1的增強作用，而PKC抑制劑GF109203X和PKG抑制劑KT5823并不能逆轉zacopride對IK1的增強效應。這提示我們，zacopride對大鼠心室肌細胞IK1的增強效應很可能經由PKA信號系統介導，PKC和PKG信號系統不參與zacopride藥理學作用的調節。到目前為止，尚沒有公認的IK1選擇性激動劑或阻斷劑，這給IK1通道的研究帶來困擾。Zacopride 對IK1的增強效應受PKA信號系統調節則可能為我們篩選IK1藥理學工具藥提供了思路和方向。

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Receptorandsignalingmechanismsinvolvedinzacopride-inducedpotentiationofIK1

LIU Qing-hua1, 3,XU Yan-wu4, WU Bo-wei2, 3

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofPhysiology,3KeyLaboratoryofCellularPhysiologyco-establishedbyMinistryofEducationofChinaandShanxiProvince,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;4DepartmentofBiochemistry,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201200,China.E-mail:liuqh20041206@163.com)

AIM: To investigate the receptor and signaling mechanisms involved in the potentiation of inward rectifier K+current (IK1) induced by zacopride, a potent 5-HT3receptor antagonist and 5-HT4receptor agonist.METHODSThe whole-cell patch clamp technique was used to recordIK1. 5-HT4-receptor antagonist RS23597-190, 5-HT3-receptor agonistm-chlorophenylbiguanide (m-CPBG), PKA inhibitor KT5720, PKC inhibitor GF109203X and PKG inhibitor KT5823 were applied respectively to determine the regulatory mechanism ofIK1.RESULTSIn the presence of RS23597-190 at concentration of 10 μmol/L which inhibitedIK1, zacopride at concentration of 1 μmol/L still increasedIK1with the mean increment of 32.5% in inward current (at -100 mV,P<0.05). TheIK1increment induced by zacopride was not inhibited bym-CPBG at concentration of 10 μmol/L (P>0.05). Furthermore, PKA inhibitor KT5720 at concentration of 5 μmol/L reversed the effect of zacopride (P<0.05), while PKC inhibitor GF109203X and PKG inhibitor KT5823 both at concentration of 5 μmol/L didn’t influence the effect (P>0.05).CONCLUSIONZacopride potentiatesIK1via a PKA-mediated signaling pathway, which is independent on 5-HT4and 5-HT3receptors.

Inward rectifier K+current; Zacopride; Receptors,5-HT

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.01.002

中國病理生理學會2012年活動計劃表