EGCG 改善高濃度TNF－α對(duì)人皮膚創(chuàng)傷愈合中成纖維細(xì)胞的抑制作用

余紅梅， 胡宏鴦， 吳 霞， 方海云△

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院1 普外科，2 皮膚科，浙江 杭州310006)

皮膚創(chuàng)口愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。成纖維細(xì)胞是創(chuàng)口愈合的主要修復(fù)細(xì)胞，它在創(chuàng)口修復(fù)過(guò)程中的增殖、遷移以及膠原的合成，直接影響其愈合［1］。創(chuàng)口局部的炎癥反應(yīng)有助于創(chuàng)口愈合過(guò)程的啟動(dòng)和完成，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致傷口的遷延不愈［2］，表現(xiàn)為愈合遲緩性皮膚傷口(delayed wound healing，DHW)。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF－α)是由多種細(xì)胞分泌的炎癥因子，對(duì)早期炎癥細(xì)胞的遷移和聚集等起到重要作用。但是目前它對(duì)于皮膚成纖維細(xì)胞的作用尚存爭(zhēng)議，認(rèn)為低濃度的TNF－α 可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增生［3］，而另有研究認(rèn)為局部TNF－α顯著增高可抑制皮膚創(chuàng)口的愈合［4－5］。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocathechin－3 gallate，EGCG)是一種茶多酚的提取物單體，它具有顯著抗炎和抗氧化作用，可以抑制皮膚成纖維細(xì)胞MMP 的合成和表達(dá)，延緩細(xì)胞老化，促進(jìn)傷口愈合［6－7］。但其對(duì)創(chuàng)口愈合中成纖維細(xì)胞的影響國(guó)內(nèi)外研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察高濃度TNF－α 對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖、遷移和膠原蛋白合成的作用以及EGCG 預(yù)處理的影響，探討EGCG 對(duì)過(guò)度炎癥反應(yīng)延遲的創(chuàng)口愈合是否有改善作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

人TNF－α(PeproTech);EGCG(Sigma);低糖DMEM 培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);0.25%胰酶(Gibco);0.25%dispaseII 酶(Gibco);山羊抗Ⅰ型膠原蛋白抗體(Santa Cruz);HRP 標(biāo)記的山羊Ⅱ抗(杭州聯(lián)科生物公司);蛋白定量試劑盒(Bio－Rad)。Cell Counting Kit－8(CCK－8)試劑盒(Dojindo)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

取健康男性青少年包皮環(huán)切術(shù)切除的包皮，剪去皮下組織，成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的皮片，碘伏浸泡5 min，PBS漂洗3 次。加入0.25% dispaseⅡ于4 ℃消化16 ～20 h，分離表、真皮，然后用0.25%胰酶37 ℃反復(fù)消化，以含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中和。200 目細(xì)胞篩過(guò)濾，1 000 r/min離心，接種至25 cm 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到80%融合，用0.25%胰酶消化傳代。取4 ～8 代細(xì)胞進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)分組

調(diào)整細(xì)胞密度為2 ×108/L，接種于6 孔板，待90%融和，予以干預(yù)分組。(1)正常對(duì)照組:未予以任何干預(yù)，含10%胎牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng);(2)TNF－α 干預(yù)組:在培養(yǎng)液中加入人TNF－α 至終濃度為10 μg/L，作用24 h;(3)TNF－α+EGCG 干預(yù)組:EGCG 預(yù)處理1 h 后，加入TNF－α 10 μg/L，作用24 h。

4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞接種于96 孔板，每孔5 ×103個(gè)。待細(xì)胞貼壁后予以相應(yīng)的干預(yù)，24 h 后向每孔加入10 μL CCK－8 溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱孵育4 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度值。

5 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞接種于6 孔板至90%融合并予以相應(yīng)干預(yù)后，用20 μL 槍頭在單層細(xì)胞上垂直劃出一細(xì)痕，制作出細(xì)胞傷口模型。劃痕后用PBS 清洗2 次，換用含1%胎牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)液以排除細(xì)胞增殖的影響，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 和48 h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞劃痕創(chuàng)面愈合程度。細(xì)胞平行遷移率(%)=(1－剩余劃痕區(qū)面積/原劃痕區(qū)面積)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

6 Western blotting 檢測(cè)

將6 孔板上的細(xì)胞用PBS 清洗3 次后，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，離心后取上清以Lowery 法蛋白定量。按每孔50 μg 蛋白上樣于10% SDS－聚丙烯酰胺凝膠，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫下封閉1 h 與Ⅰ抗結(jié)合(1∶1 000 稀釋)，4 ℃過(guò)夜，TBST 洗膜后再與Ⅱ抗室溫結(jié)合1 h，滴加ECL 液，用Image Quant LAS－4000(Fujifilm)曝光儀曝光。條帶灰度分析采用Image Multi－Gauge 軟件(Fujifilm)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 TNF－α 抑制細(xì)胞增殖以及EGCG 干預(yù)的作用

如圖1 所示，TNF－α 抑制成纖維細(xì)胞的增殖，較對(duì)照組差異顯著，而EGCG 預(yù)處理后顯著改善TNF－α 的增殖抑制作用，并呈濃度依賴性，在40 μmol/L 時(shí)即達(dá)到最大效應(yīng)。

Figure 1. The A value detected by CCK－8 assay. The A value decreased in the cells treatment with TNF－α，and it was improved by EGCG pre－treatment in a dose－dependent manner. ± s. n =5. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs EGCG(40 μmol/L)+ TNF－α.圖1 各干預(yù)組對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響

2 TNF－α 延遲細(xì)胞劃痕愈合以及EGCG 干預(yù)的作用

如圖2 所示，成纖維細(xì)胞從細(xì)胞劃痕邊緣向中心移動(dòng)。TNF－α 10 μg/L 作用24 h 后，成纖維細(xì)胞的遷移率即出現(xiàn)顯著抑制(P ＜0.05)，而EGCG(40 μmol/L)干預(yù)后則在24 h即能改善TNF－α 的延遲愈合作用(P ＜0.05);48 h 后，對(duì)照組與EGCG 干預(yù)組基本愈合(遷移率分別為91.50% 和88.83%)，而TNF－α 組愈合仍顯著延遲，遷移率為46.01%(P ＜0.05)。

3 TNF－α 抑制I 型膠原蛋白表達(dá)以及EGCG 干預(yù)的作用

如圖3 所示，TNF－α 組Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，而EGCG(40 μmol/L)干預(yù)后顯著改善collagen I的表達(dá)。

討 論

傷口愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。其延遲愈合容易引起局部感染，甚至發(fā)展為慢性非愈合傷口。成纖維細(xì)胞在皮膚創(chuàng)口愈合中起到重要作用，它經(jīng)過(guò)增殖、遷移，分泌膠原蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)和大量的生長(zhǎng)因子，與新生血管等構(gòu)成肉芽組織，填補(bǔ)創(chuàng)面，幫助表皮細(xì)胞覆蓋。

Figure 2. The migration of dermal fibroblasts measured by wound healing assay. A:cell migration at 0 h，24 h and 48 h from the scrape margin;B:quantitative analysis of the migration rates. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control.圖2 各干預(yù)組對(duì)成纖維細(xì)胞遷移的影響

Figure 3. The expression of collagen I in each group measured by Western blotting. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control.圖3 各干預(yù)組對(duì)成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

在創(chuàng)口修復(fù)的早期，局部的炎癥反應(yīng)有助于清除細(xì)菌和細(xì)胞碎片，募集單核/巨噬細(xì)胞，分泌多種細(xì)胞因子如IL－1β、TGF－β 等，刺激成纖維細(xì)胞進(jìn)入創(chuàng)面［7］。Ezoe 等［3］曾指出低濃度的TNF－α可以促進(jìn)整合素α2β1的表達(dá)。整合素α2β1作為膠原和層黏連蛋白的受體，其表達(dá)增加有助于創(chuàng)傷愈合中成纖維細(xì)胞的黏附［8］。但是延遲愈合的傷口也常伴隨炎癥細(xì)胞的過(guò)度浸潤(rùn)和膠原沉積的減少。過(guò)度的炎癥也容易引起基質(zhì)脆性增加和疤痕收縮異常［4，9］。Lai 等［5］發(fā)現(xiàn)局部的TNF－α 濃度增加可以延遲傷口愈合，也有人報(bào)道TNF－α 能拮抗TGF－β1誘導(dǎo)的成肌纖維細(xì)胞的分化和平滑肌α－肌動(dòng)蛋白的表達(dá)［4，10］，而這兩者在傷口愈合后期起關(guān)鍵作用。針對(duì)目前的爭(zhēng)議，本實(shí)驗(yàn)采用了10 μg/L 的TNF－α作用于體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)高濃度的TNF－α 顯著抑制成纖維細(xì)胞的增殖。而且在細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)中，TNF－α 組劃痕24 h 后即出現(xiàn)明顯差異，48 h 后仍未完全愈合，與對(duì)照組相比細(xì)胞遷移能力顯著受到抑制。Western blotting 也提示TNF－α 組的I 型膠原蛋白明顯下降，這也將不利于皮膚傷口的愈合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明高濃度的TNF－α對(duì)成纖維細(xì)胞的功能學(xué)表現(xiàn)有明顯抑制作用，從而影響皮膚創(chuàng)口的愈合。

近年來(lái)，茶多酚的研究越來(lái)越受到人們的重視。EGCG屬于茶多酚中提取的單體，由于其顯著的抗炎抗氧化作用，在諸多疾病如心血管疾病［11］、腫瘤［12］、炎癥性腸病［13］等中有廣泛應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)［14］，EGCG 能阻斷由紫外線B 照射誘發(fā)的皮膚白細(xì)胞浸潤(rùn)，減少氧自由基的生成，并調(diào)控角質(zhì)細(xì)胞分化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［7］也提示EGCG 可以加快小鼠皮膚的創(chuàng)口愈合，抑制小鼠傷口附近IL－1β 和MMP－1 的過(guò)度分泌。然而EGCG 對(duì)于傷口愈合的細(xì)胞學(xué)機(jī)制在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)明確報(bào)道。由于皮膚成纖維細(xì)胞在傷口愈合中起關(guān)鍵作用，本研究將高濃度TNF－α 干預(yù)的成纖維細(xì)胞用EGCG 預(yù)處理1h。我們發(fā)現(xiàn)EGCG 處理后，TNF－α 對(duì)成纖維細(xì)胞的功能學(xué)抑制明顯得到改善，增殖和遷移能力顯著恢復(fù)，被抑制的膠原蛋白表達(dá)也有增加，表明EGCG 可以抑制皮膚創(chuàng)口中過(guò)度的炎癥反應(yīng)，恢復(fù)正常的成纖維細(xì)胞功能，從而促進(jìn)傷口愈合。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察EGCG 和高濃度TNF－α 對(duì)成纖維細(xì)胞的功能學(xué)影響，闡述了高濃度TNF－α 對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖、遷移和膠原蛋白表達(dá)的抑制作用以及EGCG 的保護(hù)作用，從細(xì)胞學(xué)機(jī)制說(shuō)明了過(guò)度炎癥反應(yīng)延遲皮膚創(chuàng)口愈合，并提出了可能的治療手段。

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