大鼠急性壞死性胰腺炎和慢性胰腺炎代謝特征分析

潘春樹(shù) 馬超 田冰 汪劍 楊根金 陸建平

·論著·

大鼠急性壞死性胰腺炎和慢性胰腺炎代謝特征分析

潘春樹(shù) 馬超 田冰 汪劍 楊根金 陸建平

目的用代謝組學(xué)方法研究大鼠胰腺組織代謝特征，以期發(fā)現(xiàn)胰腺炎癥的標(biāo)記性代謝物。方法Wistar大鼠22只，按數(shù)字表法隨機(jī)分成急性壞死性胰腺炎組(ANP，7只)、慢性胰腺炎組(CP，6只)和對(duì)照組(9只)。ANP組經(jīng)腹腔注射20% L-精氨酸溶液制模；CP組經(jīng)尾靜脈注射二丁基二氯基錫(DBTC)溶液制模；對(duì)照組注射等量生理鹽水。檢測(cè)血清淀粉酶含量，胰腺組織行病理學(xué)檢查。利用高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振波譜對(duì)離體胰腺組織進(jìn)行代謝成分分析，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，比較ANP與CP的代謝特征。結(jié)果與對(duì)照組相比，ANP組小分子代謝物亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸含量增加，而CP組這些代謝物含量減少。ANP組和CP組的磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿、膽堿含量均升高，脂肪酸、乳酸、甜菜堿、甘氨酸含量均下降，CP組中脂類(lèi)代謝產(chǎn)物含量明顯高于ANP組，且僅在CP組中觀察到牛磺酸含量升高。結(jié)論胰腺炎癥疾病造成胰腺組織內(nèi)代謝異常，升高的牛磺酸水平可能是區(qū)分CP和ANP的標(biāo)記物。

胰腺炎，急性壞死性； 慢性胰腺炎； 高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振； 主成分分析

胰腺作為人體第二大器官，其代謝異常總是先于組織結(jié)構(gòu)和功能的改變，探究胰腺組織代謝產(chǎn)物對(duì)進(jìn)一步了解其發(fā)病機(jī)制和早期診斷胰腺疾病將起到重要作用。本研究利用高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振波譜技術(shù)(high-resolution proton magic angle spinning nuclear magnetic resonance,1H MAS NMR)[1]分析急性壞死性胰腺炎(ANP)和慢性胰腺炎(CP)大鼠胰腺的代謝特征。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Wistar大鼠22只，體重200～220 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按數(shù)字表法隨機(jī)分成ANP組(7只)、CP組(6只)和對(duì)照組(9只)。CP組經(jīng)尾靜脈注射DBTC(Sigma公司 8 mg/kg體重)[2]，2個(gè)月后處死。ANP組腹腔注射20% L-精氨酸溶液2.5 mg/kg體重，間隔1 h，重復(fù)注射[3]，12 h后處死。對(duì)照組注射等量生理鹽水。收集血樣本與胰腺組織。

二、病理學(xué)檢查及血清淀粉酶檢測(cè)

部分胰腺組織常規(guī)病理檢查，由2名資深病理學(xué)專(zhuān)家閱片，并從胰腺水腫、出血、壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。血樣本離心分離血清，上Hitachi 7600-120全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清淀粉酶含量。

三、1H MAS NMR分析

切取液氮保存的新鮮胰腺組織約15 mg，裝入直徑4 mm的附帶球形內(nèi)腔的Zr02轉(zhuǎn)子中，并加入適量氘水用于鎖場(chǎng)和排除空氣。實(shí)驗(yàn)在BRUKER AVANCE Ⅱ 600 NMR譜儀上完成。1H共振頻率為600.13 MHz，測(cè)試所用探頭為4 mm雙共振(1H/13C)MAS探頭，魔角旋轉(zhuǎn)速率為5 kHz，實(shí)驗(yàn)溫度為300.0k(≈27℃)。譜圖采樣點(diǎn)數(shù)64 k，譜寬15 kHz，弛豫延遲2 s，累加次數(shù)160次。均采用預(yù)飽和法壓制水峰，并利用自旋回波脈沖(Carr-Purcell-Meiboon-Gill,CPMG)序列壓制大分子及其他一些短T2物質(zhì)的信號(hào)，自旋-自旋弛豫總時(shí)間為180 ms。同時(shí)，還對(duì)各組胰腺樣本進(jìn)行2D NMR實(shí)驗(yàn)，包括1H-1H 相關(guān)波譜(COSY)和1H-1H總相關(guān)波譜(TOCSY)實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)胰腺組織的NMR特征峰進(jìn)行指認(rèn)[4]。

利用Bruker公司的Topspin 3.1軟件對(duì)NMR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相位、基線校正。利用AMIX軟件(版本3.9.5)對(duì)簡(jiǎn)化后的數(shù)據(jù)組進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，即圖譜進(jìn)行簡(jiǎn)化降維處理，得到相應(yīng)的得分圖(scores)和負(fù)載圖(loadings)。

結(jié) 果

一、血清淀粉酶水平

ANP組血清淀粉酶水平為(3527±429)U/L，明顯高于CP組的(2926±302)U/L和對(duì)照組的(2820±169)U/L。

二、胰腺病理改變

CP組見(jiàn)胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，腺泡消失，炎性細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，纖維組織大量增生，廣泛間質(zhì)纖維化。ANP組見(jiàn)胰腺水腫、出血及黃白鈣化點(diǎn)，腺泡結(jié)構(gòu)破壞，大片組織壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組胰腺組織未見(jiàn)明顯病理改變(圖1)。

圖1對(duì)照組(a)、ANP組(b)及CP組(c)胰腺病理改變(HE ×200)

三、1H MAS NMR分析結(jié)果

對(duì)照組、ANP組及CP組具有代表性1H MAS NMR波譜見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，ANP組亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ileu)、纈氨酸(Val)峰信號(hào)明顯增加，CP組則明顯降低。牛磺酸(Tau)峰信號(hào)僅在CP組觀察到。此外，ANP組和CP組中均可見(jiàn)甘油磷酸膽堿+磷酸膽堿(GPC/PC)和膽堿(Cho)峰增加，乳酸(Lac)、甜菜堿(Bet)、甘氨酸(Gly)峰降低。

圖2對(duì)照組(a)、ANP組(b)及CP組(c)1H MAS NMR譜圖

對(duì)CPMG譜中δ0.50-9.00 ppm化學(xué)位移范圍數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，得到得分圖和相應(yīng)的負(fù)載圖(圖3a，b)。在得分圖中各組表現(xiàn)出組間相似性，在PC1方向上，CP組距離與對(duì)照組很近，但遠(yuǎn)離ANP組。由負(fù)載圖可知脂質(zhì)代謝物(δ0.95-0.85 ppm, δ1.40-1.25 ppm,δ2.10-2.00 ppm,δ5.35-5.30 ppm)、Lac(δ1.40-1.35 ppm)、GPC/PC(δ3.25-3.2 ppm)對(duì)得分圖中3組的區(qū)分起了很大的作用。為消除脂類(lèi)化合物的影響，再對(duì)δ2.90-9.00 ppm化學(xué)位移范圍內(nèi)的譜圖進(jìn)行PCA分析，得到得分圖和負(fù)載圖(圖3c，d)。得分圖在PC1方向上，CP組緊挨ANP組，但遠(yuǎn)離對(duì)照組。負(fù)載圖得出Gly(δ4.35-4.25 ppm)、Lac(δ4.15-4.05 ppm)、Cho(δ3.60-3.55 ppm)、Bet(δ3.30-3.25 ppm)、Tau(δ3.45-3.40 ppm)和GPC/PC(δ3.75-3.65 ppm,δ3.25-3.2 ppm)，對(duì)得分圖中3組區(qū)分起的作用很大。

圖3由1H NMR CPMG譜圖PCA分析得到的得分圖及負(fù)載圖(a、b為δ0.50-9.00 ppm分析結(jié)果；c、d為δ2.90-9.00 ppm分析結(jié)果；▲為對(duì)照組，■為ANP組，●為CP組)

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Gly、Lac、Bet、Cho、GPC/PC、Leu/Ileu/Val及FA在胰腺中的代謝與ANP和CP存在著相互聯(lián)系。相對(duì)于CP組，ANP組中可見(jiàn)Leu/Ileu/Val含量增加，Tau和FA含量降低。

Tau是一種細(xì)胞內(nèi)自由氨基酸，來(lái)源于食物攝取和體內(nèi)合成兩種途徑。它參與血清膽固醇、血糖和細(xì)胞內(nèi)鈣水平的調(diào)節(jié)[5]。僅CP組觀察到Tau信號(hào)增強(qiáng)，可能是潛在區(qū)分CP與ANP的標(biāo)志物。Gly是一種抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)因子和抗氧化劑；乳酸鹽是無(wú)氧酵解產(chǎn)物，可在缺血、缺氧時(shí)升高；Bet是體內(nèi)重要的甲基供體，可為同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸和二甲基甘氨酸提供甲基。這些氨基酸對(duì)維持肝臟和胰腺正常功能、細(xì)胞復(fù)制及解毒功能起支持作用。本結(jié)果顯示，CP和ANP組Gly、Lac、Bet含量均較對(duì)照組下降，表明CP和ANP時(shí)需要消耗這些代謝產(chǎn)物來(lái)為胰腺解毒。

胰腺內(nèi)脂質(zhì)含量通常與諸多因素有關(guān)，例如：遺傳、年齡、性別、習(xí)慣等[6]。CP組的脂質(zhì)水平與對(duì)照組相比稍微下降，而ANP組的脂質(zhì)水平則較對(duì)照組明顯下降。CP較ANP具有更豐富的脂質(zhì)代謝，反映了胰腺炎癥過(guò)程中兩者之間代謝的區(qū)別。

膽堿類(lèi)代謝物信號(hào)是由Cho、GPC及PC峰疊加而成[7]。膽堿類(lèi)代謝產(chǎn)物常作為標(biāo)記物，其含量的增加是腫瘤細(xì)胞快速增殖的結(jié)果[8]。雖然胰腺炎癥不會(huì)引起細(xì)胞的快速增殖，但本結(jié)果顯示ANP和CP組存在較高的總膽堿水平。這是由于膽堿激酶和磷酸肌酸轉(zhuǎn)移酶的阻滯或者經(jīng)胞苷二磷膽堿(CDP-Cho)代謝途徑的磷酸肌酸大量消耗所致。因此，膽堿類(lèi)代謝物也可能是CP和ANP炎癥過(guò)程中有特點(diǎn)的代謝產(chǎn)物。

[1] 何新紅，陸建平，方芳，等.大鼠慢性胰腺炎離體組織塊高分辨氫質(zhì)子磁共振波譜分析.中華胰腺病雜志，2008，8:393-396.

[2] Merkord J, Weber H, Sparmann G, et al. The course of pancreatic fibrosis induced by dibutyltin dichloride (DBTC). Ann N Y Acad Sci,1999,880:231-237.

[3] Dabrowska A,Jacewicz D,Lapińska A,et al.Pivotal participation of nitrogen dioxide in L-arginine induced acute necrotizing pancreatitis:protective role of superoxide scavenger 4-OH-TEMPO.Biochem Biophys Res Commun,2005,326:313-320.

[4] Griffin JL, Mann CJ, Scottc J, et al. Choline containing metabolites during cell transfection: an insight into magnetic resonance spectroscopy detectable changes. FEBS Lett, 2001, 509:263-266.

[5] E1-Sayed S, Bezabeh T, Odlum O, et al. An ex vivo study exploring the diagnostic potential of 1H magnetic resonance spectroscopy in squamous cell carcinoma of the head and neck region. Head Neck, 2002,24: 766-772.

[6] Zyromski NJ, Mathur A, Gowda GA, et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy-based metabolomics of the fatty pancreas: implicating fat in pancreatic pathology. Pancreatology,2009,9:410-419.

[7] Braganza JM, Lee SH, McCloy RF, et al. Chronic pancreatitis. Lancet,2011,377:1184-1197.

[8] Zhang H, Wang Y, Gu X, et al. Metabolomic profiling of human plasma in pancreatic cancer using pressurized capillary electrochromatography. Electrophoresis,2011,32:340-347.

Metabolicfeaturesofacutenecrotizingpancreatitisandchronicpancreatitis

PANChun-shu,MAChao,TIANBing,WANGJian,YANGGen-jin,LUJian-ping.
DepartmentofRadiology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

YANGGen-jin,Email：gjinyang@hotmail.com；LUJian-ping,Email:cjr.lujianping@vip.163.com

ObjectiveTo study the metabolite features of acute necrotizing pancreatitis (ANP) and chronic pancreatitis (CP) in rats.MethodsA total of 22 Wistar rats were divided into ANP group (n=7), CP group (n=6) and the control group (n=9). ANP model was induced peritoneous injection of 20% L-arginine, and the rats were sacrificed 12 hours later. CP model was induced by intravenously injection of DBTC (8 mg/kg body weight), and the rats were sacrificed after 2 months. The rats in the control group

same amount of saline. Serum amylase was determined and pancreatic tissues were pathologically examined. Metabolic changes of pancreatic tissues in vitro were studied by high resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance (MAS NMR), and analyzed by using principal components analysis (PCA). Characteristic metabolites of ANP and CP were compared.ResultsCompared with the control group, increased leucine, iso-leucine and valine levels were observed in ANP group, however, the opposite trends were observed in CP group. Phosphocholine, glycerophosphocholine, choline levels were increased and fatty acids, lactate, betaine, glycine levels were decreased in both ANP and CP groups. The lipid content in CP group were significantly higher than that in ANP group and the increased taurine was only observed in CP group.ConclusionsThere were obvious metabolic features in pancreatic tissue in rats with pancreatitis disorders, and the increased taurine could be used as biomarker to discriminate ANP and CP.

Pancreatitis, acute necrotizing； Chronic pancreatitis； Magic angle spinning nuclear magnetic resonance； Principal components analysis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.016

國(guó)家自然科學(xué)基金(30870709)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院放射科(潘春樹(shù)、馬超、田冰、汪劍、陸建平)，藥學(xué)院分析測(cè)試中心(楊根金)

楊根金，Email：gjinyang@hotmail.com；陸建平，Email：cjr.lujianping@vip.163.com

2011-07-20)

(本文編輯：屠振興)