胰島素對人胰腺癌PANC1細胞增殖與侵襲能力的影響

劉濤 王統玲 勾善淼 殷濤 汪理 周偉 李永峰 王春友

·論著·

胰島素對人胰腺癌PANC1細胞增殖與侵襲能力的影響

劉濤 王統玲 勾善淼 殷濤 汪理 周偉 李永峰 王春友

目的研究胰島素對人胰腺癌PANC1細胞增殖、侵襲能力及細胞低氧誘導因子(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法采用0.1、1、10、100 nmol/L胰島素處理PANC1。噻唑藍法和Transwell小室侵襲實驗檢測細胞增殖和侵襲能力；蛋白質印跡法和實時PCR法檢測增殖性細胞核抗原(PCNA)及HIF-1α、VEGF蛋白和mRNA的表達。結果胰島素呈劑量依賴性誘導PANC1細胞的增殖，上調HIF-1α、VEGF蛋白表達。100 nmol/L胰島素干預4 d，PANC1細胞的PCNA蛋白表達顯著上調(1.196±0.014比1.157±0.013，P<0.05)；Transwell小室穿膜細胞數量顯著增加[(141.0±2.1)個比(89.0±1.4)個，P<0.05]；HIF-1α蛋白表達顯著上調(1.139±0.020比0.598±0.013，P<0.05)，但HIF-1α mRNA表達無明顯變化；VEGF蛋白表達顯著上調(1.011±0.023比0.627±0.013，P>0.05)，VEGF mRNA表達亦顯著上調(0.970±0.016比0.350±0.013，P<0.05)。結論高胰島素微環境可誘導PANC1細胞增殖，并通過上調HIF-1α及VEGF的表達增強細胞的侵襲能力。

胰腺腫瘤； 胰島素； 增殖； 侵襲； 微環境

胰腺內、外分泌部結構關系緊密，血流經胰島到達外分泌部，胰島分泌的胰島素、胰高血糖素、生長抑素等透過管壁到達腺泡細胞間液營養外分泌細胞[1]。局部組織的胰島內分泌激素濃度高于體循環[2]，形成了胰腺癌特有的微環境。研究顯示，局部高胰島素微環境可能促進胰腺癌局部生長與浸潤[3]。本實驗觀察胰島素對人胰腺癌細胞PANC1增殖、侵襲能力及低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。

材料與方法

一、細胞培養

PANC1細胞由協和醫院普通外科實驗室提供，常規培養、傳代。取對數生長期細胞，按每孔1000個細胞接種于96孔培養板，培養液中加入終濃度為0.1、1、10、100 nmol/L的胰島素(Sigma公司)，以不加胰島素為對照。每2 d換液。每隔24 h每孔加入噻唑藍20 μl培養4 h，再加150 μl二甲亞砜溶解的甲瓚，測每孔490 nm處吸光值(A490)。每個濃度設5個復孔，連測7 d。以細胞生長時間為橫軸，A490值為縱軸繪制生長曲線。

二、Transwell小室侵襲實驗

在Transwell小室(BD公司)上室加入1×105個100 nmol/L胰島素處理的細胞或對照組細胞。下室加入500 μl含血清的培養液，37℃培養24 h，擦去上室面細胞，HE染色，鏡下選擇中央及四周5個視野，計膜下室面細胞數。實驗重復3次。

三、蛋白質印跡法

取0、0.1、1、10、100 nmol/L胰島素處理4 h及100 nmol/L胰島素處理0、2、4、8、12、24 h的PANC1細胞，提取細胞總蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測增殖性細胞核抗原(PCNA)、HIF-1α、VEGF蛋白的表達，以GAPDH作為內參。兔抗人PCNA一抗購于Thermo公司，兔抗人HIF-1α、VEGF和GAPDH一抗均購于Santa Cruz公司。以目的蛋白與內參條帶的灰度比值表示蛋白表達量。

四、實時PCR法

取100 nmol/L胰島素處理4 h的PANC1細胞，用Trizol提取細胞總RNA。先逆轉錄成cDNA，然后行實時定量PCR。HIF-1α引物上游5′-TGAAGTGTACCCTAACTAGCCG-3′，下游5′-AATCAGCACCAAGCAGGTCATAG-3′，片段158 bp；VEGF引物上游5′-GAGGGCAGAATCATCACGAAG-3′，下游5′-AGGGAACGCTCCAGGACTTAT-3′，片段402 bp；內參β-actin引物上游5′-AAGGCCAGGTAATTGTCACG-3′，下游5′-AGCAGC TCTGCAGTACGTC-3′，片段105 bp。引物均由上海生工生物技術有限公司合成。PCR反應條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，45個循環。獲取各組標本的標準曲線，計算機分析Ct值，待測樣品mRNA表達量=2-△△Ct，△△Ct=(△Ct內參-△Ct樣品)。

五、統計學分析

結 果

一、胰島素對PANC1增殖能力的影響

胰島素呈劑量依賴性誘導細胞的增殖(圖1)。100 nmol/L胰島素干預1、2、4 d后，細胞PCNA蛋白的表達量為0.977±0.009、1.155±0.013、1.196±0.014，較對照組0.891±0.010、1.101±0.012、1.157±0.013的表達量顯著上調(P<0.05，圖2)。

圖1 不同濃度胰島素對PANC1生長的影響

圖2胰島素干預組(a)和對照組(b)細胞的PCNA蛋白表達

二、胰島素對PANC1侵襲能力的影響

對照組穿膜細胞數為(89.0±1.4)個，100 nmol/L胰島素處理組為(141.0±2.1)個(圖3)，兩組差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖3胰島素干預組(a)和對照組(b)的穿膜細胞(HE ×100)

三、PANC1細胞HIF-1α 、VEGF蛋白表達變化

0.1、1、10、100 nmol/L胰島素處理4 h后，細胞HIF-1α蛋白表達量分別為0.958±0.018、0.996±0.011、1.116±0.011、1.147±0.016，呈劑量依賴性，均較對照組的0.617±0.009顯著上調(P值均<0.05)；VEGF蛋白表達量為0.945±0.016、0.981±0.011、1.106±0.012、1.120±0.010，呈劑量依賴性，亦均較對照組的0.789±0.012顯著上調(圖4a，P值均<0.05)。100 nmol/L胰島素處理2、4、8、12、24 h后，細胞HIF-1α蛋白表達量分別為0.891±0.018、1.139±0.020、1.101±0.016、0.874±0.014、0.615±0.011，除24 h點外均較對照組的0.598±0.013顯著上調(P值均<0.05)；VEGF表達量分別為0.917±0.019、1.011±0.023、1.118±0.020、1.157±0.018、1.162±0.016，均較對照組的0.627±0.013顯著上調(圖4b，P值均<0.05)。

圖4不同濃度胰島素干預4 h和100 nmol/L胰島素干預不同時間的PANC1細胞的HIF-1α、VEGF蛋白表達

四、PANC1細胞HIF-1α 、VEGF mRNA表達變化

100 nmol/L胰島素處理4 h后，細胞HIF-1α mRNA表達量為0.910±0.012，與對照組的0.880±0.011無顯著差異；VEGF mRNA表達量為0.970±0.016，較對照組的0.350±0.013顯著上調(P<0.05)。

討 論

流行病學調查顯示，2型糖尿病是胰腺癌的獨立危險因素，伴2型糖尿病的胰腺癌患者體內胰島素水平升高，可能影響胰腺癌的惡性生物學行為[4]。此外，胰腺癌細胞表達胰島素受體[5]，胰腺癌組織中散在分布內分泌細胞[6]。Wang等[7]將鼠胰島細胞與人胰腺癌細胞共培養，發現培養液中存在高濃度胰島素，促進癌細胞生長和對葡萄糖的利用。但胰高血糖素與生長抑素無此作用[8]。本實驗結果顯示，胰島素以劑量依賴性方式促進胰腺癌細胞增殖，且明顯促進癌細胞的侵襲轉移能力。

胰腺癌組織HIF-1α高表達，與胰腺癌的惡性生物學行為相關[9]；胰島素可與低氧協同誘導胰腺癌細胞HIF-1α表達，增加腫瘤細胞對葡萄糖的利用[1]。本實驗結果顯示，常氧條件下胰島素明顯誘導HIF-1α、VEGF表達上調，但24 h時HIF-1α表達恢復到處理前水平，考慮是胰島素耗盡后HIF-1α在常氧下被降解所致。然而，胰島素并不能影響HIF-1α mRNA的表達，卻能誘導VEGF mRNA表達，提示胰島素對HIF-1α的調控處于翻譯后水平，對VEGF的調控處于轉錄水平。

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EffectsofinsulinonproliferationandinvasionofhumanpancreaticcancerPANC1cells

LIUTao,WANGTong-ling,GOUShan-miao,YINTao,WANGLi,ZHOUWei,LIYong-feng,WANGChun-you.
DepartmentofPancreaticSurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

WANGChun-you,Email:chunyouwang@mail.hust.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effects of insulin on the proliferation and invasion of human pancreatic cancer cells PANC1, and on its HIF-1α, VEGF expression.MethodsPANC1 was pretreated with insulin of different concentrations (0.1, 1, 10, 100 nmol/L). The proliferation of PANC1 was tested by MTT method, and transwell assay was used to test the invasion ability of PANC1. HIF-1α, VEGF and PCNA protein expression was assessed by Western blots, and HIF-1α, VEGF mRNA was detected by real-time PCR.ResultsInsulin could increase the proliferation of PANC1 in a dose-dependent manner (p<0.05), and increase the expression of HIF-1α, VEGF protein. After 100 nmol/L insulin treatment for 4 d, the PCNA protein expression in the insulin group was significantly higher than that in the control group (1.196±0.014vs1.157±0.013,P<0.05). The cancer cells passed through the chamber in insulin group were much more than that in the control group (141.0±2.1vs89.0±1.4,P<0.05). The expression of HIF-1α protein was significantly increased (1.139±0.020vs0.598±0.013,P<0.05), while there was no significant change of HIF-1α mRNA expression. Both the expression of VEGF protein and mRNA were significantly increased (1.011±0.023vs0.627±0.013 0.970±0.016vs0.350±0.013,P<0.05).ConclusionsHigh insulin microenvironment could enhance the proliferation and invasion of PANC1 cells by up-regulating the expression of HIF-1α and VEGF.

Pancreatic neoplasms； Insulin； Proliferation； Invasion； Microenvironment

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.007

國家自然科學基金(30801098)

430022 湖北武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院胰腺外科

王春友，Email:chunyouwang@mail.hust.edu.cn

2011-04-07)

(本文編輯：呂芳萍)