牙體修復性納米羥基磷灰石復合材料生物相容性評價

李 瑞，王青山，趙蒙蒙，王 云

(山東:1.濱州醫學院附屬醫院口腔內科，濱州 256603;2.市人民醫院，聊城 252000)

牙體修復材料不僅與牙齒長期直接接觸，而且還與口腔軟組織和唾液相接觸，因此，必須具有良好的生物相容性和生物學活性。納米羥基磷灰石作為一種新型的生物材料，以其優異的性能已在牙科和骨科領域廣泛應用，并展現出誘人的前景［1－3］。本研究在成功研制出牙體修復性納米羥基磷灰石復合材料的基礎上，旨在進一步通過動物在體實驗初步評價該材料的生物相容性，為臨床應用提供實驗室依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及其浸提液的制備

參照文獻［4－5］將納米羥基磷灰石與樹脂基體按質量分數55∶45的比例混合，制成牙體修復性納米羥基磷灰石復合材料［4－5］，并在模具中制備成直徑(15.0 ±0.1)mm，高(3.0 ±0.1)mm 的圓柱形試件，光照固化，備用。

取20個試件，用無水乙醇超聲清洗20 min，干燥后在121℃、33 MPa壓力下滅菌處理，然后分別放入2個無菌廣口瓶中(每瓶10個)，按照材料表面積與浸提介質之比為1 cm2/mL的比例，在每瓶中加入生理鹽水49.50 mL，置于37℃培養箱中浸提72 h，浸提液過濾、分裝，37℃恒溫箱內保存備用［6］。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗

取體質量350 g左右，2月齡健康SD大鼠10只(山東中醫藥大學實驗動物中心)，隨機分為實驗組和對照組，每組5只。分別記錄每只大鼠的初始體質量后，實驗組大鼠經尾靜脈注入納米羥基磷灰石復合材料浸提液1 mL，對照組注射等量生理鹽水。分別于注射后24、48、72 h稱量每只大鼠體質量，觀察注射后呼吸、活動、反應、有無中毒、死亡等情況，記錄結果［7－8］。

1.2.2 過敏性試驗

取健康SD大鼠20只，隨機分為實驗組和對照組，實驗組腹腔注射復合材料浸提液0.2 mL，隔日注射1次，連續3次，其中5只于首次注射后14 d再次腹腔注射2 mL浸提液，另外5只于首次注射后21 d再次注射2 mL浸提液。對照組分別在相同時間點注射等量生理鹽水。每次注射后均觀察15 min，特別是末次注射后仔細觀察有無用爪搔鼻、噴嚏、豎毛、抽搐、呼吸困難、大小便失禁、休克、死亡等反應［7－8］。

1.2.3 熱原試驗

健康SD大鼠6只，雌雄不限，先相同環境，同一飼料飼養7 d，觀察SD大鼠體質量無減輕，精神、食欲、排泄等無異常后，再進行基礎體溫測量。測量體溫時將肛溫計插入肛門深度約5 cm，保持2 min。每天早晚各測量1次，連續3 d，所有大鼠的體溫均在37.6～38.0℃的范圍內，且最高與最低體溫的差值不超過0.4℃，符合熱原試驗要求。然后，每只大鼠均由尾靜脈注射納米羥基磷灰石復合材料浸提液1 mL，再按上述方法測量注射后體溫，每隔30 min測量1次，連續6次。6次體溫中最高的1次減去正常體溫即為實驗大鼠體溫升高值。所有測試均在22℃環境下進行［7－8］。

1.2.4 黏膜刺激試驗

取納米羥基磷灰石復合材料在模具內制備成直徑5 mm、厚1 mm的圓片，光照固化后，高溫高壓滅菌備用。取健康SD大鼠10只，口腔內外進行清潔消毒后，隨機分為實驗組和對照組(每組5只)。分別將實驗材料圓片和高壓滅菌后的同樣規格的牙膠圓片(對照材料)置于口腔兩側頰黏膜表面，用醫用縫合線穿頰與皮膚縫合，使試片固定在頰黏膜上，并確保密合無壓迫。術后14 d觀察與試片接觸的黏膜表面有無充血、糜爛、潰瘍、水腫等反應［7－8］。并按口腔黏膜刺激臨床分級標準進行評分(表1)。

表1 口腔黏膜刺激臨床分級標準

1.2.5 皮膚刺激試驗

取健康SD大鼠10只，背部3 cm×3 cm范圍(以脊柱為中線)皮膚脫毛，在椎旁兩側1.0 cm處各選3個注射點，間距1 cm，左側皮內注射納米羥基磷灰石復合材料浸提液，右側皮內注射生理鹽水，每點注射1 mL。分別于注射后 6、24、48、72 h，觀察皮膚反應情況［7－8］。皮膚刺激反應記分標準見表2。刺激反應總評定:0分為無刺激，＜1.9分為輕度刺激，2.0 ～4.9 分為中度刺激，5.0 ～8.0 分為強刺激。

表2 皮膚刺激反應記分標準

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，組間比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 急性全身性毒性試驗

2.1.1 一般情況

試驗材料浸提液注射后24、48、72 h各時間點，實驗動物無一死亡，活動食欲正常，呼吸平穩，無驚厥、癱瘓、呼吸抑制、腹瀉、運動減少、體質量下降等現象。實驗組和對照組比較無差異。

2.1.2 體質量變化

在72 h觀察期內，實驗組和對照組所有大鼠體質量都有不同程度地增加，而且兩組體質量相比，差異無統計學意義(P＞0.05)(表3)。

表3 實驗組與對照組體質量變化比較(g，)

表3 實驗組與對照組體質量變化比較(g，)

注射后體質量24 h 48 h 72 h試驗組 350.64 ±2.55 351.40 ±2.57 352.70 ±2.58 353.84組別 注射前體質量±2.44對照組 350.50 ±2.37 350.50 ±2.37 351.28 ±2.41 353.30±2.50

2.2 過敏試驗

末次注射后所有實驗動物一般情況良好，均未出現豎毛、抽搐、噴嚏、呼吸困難、用爪搔鼻、休克、大小便失禁、死亡等反應。表明納米羥基磷灰石復合材料浸提液和生理鹽水在過敏試驗中均為陰性反應。

2.3 熱原試驗

按ISO醫療器械評價標準［9］，如果注射后體溫升高達0.4℃或每3只大鼠的體溫升高總和大于1.4℃為陽性，表示材料浸提液有致熱作用。本研究6只大鼠中均無注射后體溫升高達0.4℃，而且每3只大鼠的體溫升高總和均小于1.4℃(表4)，說明該材料的浸提液無致熱作用。

表4 納米羥基磷灰石復合材料浸提液注射前后體溫變化(℃)

2.4 黏膜刺激試驗

所有受試動物均未出現全身不良反應，實驗材料試樣均無松動，無脫落，與試樣相接觸的頰黏膜未見粗糙、紅腫、糜爛或潰瘍等反應。所有動物反應評分均為0。

2.5 皮膚刺激試驗

皮內注射后6、24、48、72 h材料浸提液組和生理鹽水組各注射點均無紅腫、滲液、潰爛等情況出現，未見明顯皮膚刺激癥狀，表明材料浸提液與生理鹽水相似，無刺激性(表5)。

表5 皮膚原發刺激試驗結果、原發刺激指數(PⅡ)及評分情況 (n=6)

3 討論

尋找理想的牙體修復材料是牙科領域研究的重點內容之一，盡管目前使用的修復材料的機械和生物學性能均有顯著提高，但與牙體硬組織性能相近且具有生物活性的牙體缺損修復材料仍然未能應用于臨床。羥基磷灰石不僅可以中和口腔中的酸性物質，而且其較高的溶解反應還能夠最大限度的提高唾液中鈣、磷離子的濃度，推動羥基磷灰石的沉淀—溶解平衡向形成羥基磷灰石結晶的方向移動。有研究報道:羥基磷灰石具有抑制口腔內細菌生長繁殖、預防齲病、促進早期齲再礦化等功能，可用于顱骨缺損修復，引導牙周組織再生等［10］。Skrtic等將羥基磷灰石前驅體作為填料加入復合樹脂中，發現其能在仿口腔環境的緩沖液中轉換為羥基磷灰石，并穩定釋放鈣、磷離子，促進牙齒再礦化［11］。雖然人工合成的羥基磷灰石生物替代材料具有與天然羥基磷灰石一樣的生物相容性，但是由于羥基磷灰石自身的脆性大、強度低、韌性、力學性能較差等限制了其作為牙體修復材料的應用［12］。

近年來的一系列研究已初步證明，納米羥基磷灰石不僅具有天然羥基磷灰石的特點和結構，在力學性能上也與牙齒硬組織具有高度相似性，既保持了羥基磷灰石材料的生物相容性和生物活性的優點，而且又克服了羥基磷灰石自身的缺陷，具有更強的生物活性和特異性［13－14］。將其與機械能優良的樹脂一起制成復合材料，則能充分發揮兩者的性能優勢。

本研究通過將硅烷偶聯劑KH－570進行表面處理后的納米羥基磷灰石與配制好的光固化樹脂基質共混，制備成牙體修復性納米羥基磷灰石復合材料，在完成物理和化學性能、加工性能、外形等有效性設計，并經檢測確定其機械性能達到了牙體修復材料基本性能要求的基礎上［14］，參照ISO醫療器械評價標準［9］，通過急性毒性實驗、熱原實驗、過敏實驗、口腔黏膜刺激實驗、皮膚刺激實驗，以初步評價該材料的生物相容性。結果顯示:全身急性毒性試驗兩組大鼠體質量增加無明顯差異，未發現全身急性毒性，符合相關標準。復合材料浸提液組和生理鹽水組在過敏試驗和皮膚刺激試驗中所引起的反應大致相同，均為陰性反應，表明無刺激性和致敏性。熱源試驗結果表明復合材料符合熱源試驗檢查要求，無致熱作用。黏膜刺激試驗中與受試試樣相接觸的頰黏膜未見粗糙、紅腫、糜爛、潰瘍反應，原發刺激指數為0，證實該復合材料對口腔黏膜無刺激性。

［1］Sato M，Aslani A，Sambito MA，et al.Nanocrystalline hydroxyapatite/titania coatings on titanium improves osteoblast adhesion［J］.J Biomed Mater Res A，2008，84(1):265 －272.

［2］富建明，苗波，賈劉合，等.納米羥基磷灰石修復兔頜骨的組織學分析［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，(3):171－174.

［3］Fukui N，Sato T，Kuboki Y，et al.Bone tissue reaction of nano－thydroxyapatite/collagen composite at the early stage of implantation［J］.Biomed Mater Eng，2008，18(1):25 －33.

［4］王云，王青山.牙體修復性納米羥基磷灰石復合材料的機械性能研究［J］.現代口腔醫學雜志，2011，25(2):115－117.

［5］Lee JH，Um CM，Lee IB.Rheological properties of resin composites according to variations in monomer and filler composition［J］.Dent Mater，2006，22(6):515 －526.

［6］要秉文，張光磊，田秀淑，等.牙科全瓷修復用長石瓷的生物相容性評價［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(14):2671－2674.

［7］Sun Y，Lacour SP，Brooks RA，et al.Assessment of the biocompatibility of photosensitive polyimide for implantable medical device use［J］.J Biomed Mater Res A，2009，90(3):648 －655.

［8］Cai X，Tong H，Shen X，et al.Preparation and characterization of homogeneous chitosan－polylactic acid/hydroxyapatite nanocomposite for bone tissue engineering and evaluation of its mechanical properties［J］.Acta Biomater，2009，5(7):2693 －2703.

［9］標準出版社第一編輯室編.醫療器械生物學評價標準匯編［M］.北京:中國標準出版社，2005.

［10］王云，王青山.納米羥基磷灰石及其復合材料在口腔醫學中的應用［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(8):1426－1428.

［11］Skrtic D，Antonucci JM.Dental composites based on amorphous calcium phosphate－resin composition/physicochemical properties study［J］.J Biomater Appl，2007，21(4):375 －393.

［12］Deng XM，Hao JY，WANG CS.Preparation and mechanical properties of nanocomposites of poly(D，L－lactide)with Ca－deficient hydroxyapatite nanocrystals［J］.Biomat，2001，22(21):2867－2873.

［13］Sadat－Shojai M，Atai M，Nodehi A，et al.Hydroxyapatite nanorods as novel fillers for improving the properties of dental adhesives:synthesis and application［J］.Dent Mater，2010，26(5):471－482.

［14］Rauschmann MA，Wichelhaus TA，Stirnal V，et al.Nanocrystalline hydroxyapatite and calcium sulphate as biodegradable composite carrier material for local delivery of antibiotics in bone infections［J］.Bioma，2005，26a(15):2677－2684.