妊娠中期因子在牙周炎治療前后的表達(dá)情況

王 麗，焦曉輝，李曉紅

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001)

妊娠中期因子(midkine，MK)是Muramatsa等(1988)［1］在視黃酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎腫瘤細(xì)胞系HM-1細(xì)胞cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的，屬于胚胎發(fā)育涉及時(shí)空調(diào)控分子，作為一種肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)，加強(qiáng)纖溶酶原激活劑活性，參與創(chuàng)傷修復(fù)等作用。近年的研究發(fā)現(xiàn):MK作為一種生長(zhǎng)因子，其功能首先被定位于神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和分化，以后又發(fā)現(xiàn)在消化、循環(huán)、呼吸、血液、骨骼、泌尿、生殖等諸多系統(tǒng)中都有MK的存在，MK不僅與正常的生理功能有關(guān)，還與炎癥、創(chuàng)傷、修復(fù)及腫瘤等病理生理有關(guān)，并有著重要作用，目前作為一種多功能生長(zhǎng)因子已被廣泛認(rèn)同［2］。牙周炎是一種慢性細(xì)菌感染性疾病，隨著對(duì)牙周病發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步了解，已經(jīng)清楚地認(rèn)識(shí)到牙周病是多因素疾病，牙周微生物與宿主的相互作用，導(dǎo)致牙周局部有害和有利作用的不同平衡，決定了牙周病的類型、程度和轉(zhuǎn)歸的不同。本研究采用免疫組織化學(xué)、Western免疫印跡方法檢測(cè)MK在牙周炎治療前后的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

兔抗人Midkine抗體、即用型免疫組化S-P試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司);兔抗β-Actin多克隆抗體、抗兔IgG(博士德生物工程有限公司);LEICA SM 2000R產(chǎn)石蠟切片機(jī)(德國(guó));YT-6C生物組織攤烤機(jī)(湖北);HH-W21-600型電熱恒溫水浴箱(上海);Olympus-BX-51顯微鏡(日本)。

1.2 方法

1.2.1 牙周炎動(dòng)物模型的建立

取體質(zhì)量100～150 g 7周齡雄性Wistar大鼠(哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)50只，均牙列完整，牙周牙體無(wú)損傷、無(wú)發(fā)育異常和炎癥。按隨機(jī)設(shè)計(jì)原則，分為正常對(duì)照組(10只)、炎癥組和恢復(fù)組(每組20只)。炎癥組和恢復(fù)組大鼠用正畸結(jié)扎絲于全牙列牙頸部齦緣水平進(jìn)行結(jié)扎，并飼以Keyes 2000(果糖56%、脫質(zhì)奶粉28%、面粉6%、酵母4%、苜宿粉3%、動(dòng)物肝粉1%、食鹽2%及少量蔬菜)。6周后，處死炎癥組大鼠并制取標(biāo)本(牙齦上皮和部分結(jié)締組織);恢復(fù)組大鼠除去結(jié)扎絲進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療，術(shù)后6周處死并制取標(biāo)本(牙齦上皮和部分結(jié)締組織)。所有標(biāo)本均保存于液氮中。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)

取正常對(duì)照組、炎癥組和恢復(fù)組大鼠牙周組織標(biāo)本，經(jīng)40 g/L中性多聚甲醛固定后，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片用 APES處理的載玻片撈片，37℃烘烤，分別進(jìn)行HE染色、MK免疫組織化學(xué)染色。(操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行)，光學(xué)顯微鏡下觀察，以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例表示:光鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%者為陰性(-)，6% ～15%者為弱陽(yáng)性(+)，16% ～50%者為中強(qiáng)陽(yáng)性(++)，＞50%者為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.2.3 Western-blotting 檢測(cè)

分別取炎癥組、恢復(fù)組大鼠牙周組織(牙齦上皮全層和部分結(jié)締組織)50 mg，進(jìn)行裂解、勻漿，取上清液 8 μL 變性 10 min，點(diǎn)樣，以 150 g/L、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至尼龍膜，用50 g/L脫脂奶粉封閉過(guò)夜。用1∶500兔抗人MK抗體室溫孵育1.5 h，TBS-T充分洗滌，將該膜置于1∶1000鼠抗兔IgG室溫孵育1.5 h，TBS-T充分洗滌，暗室中使用ECL試劑盒顯影、定影、洗片。采用BANDLEADER分析軟件掃描，分析各條帶的光密度值，作為目的蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn);計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色

MK陽(yáng)性表達(dá)于齦上皮、溝內(nèi)上皮和結(jié)合上皮細(xì)胞胞漿中，呈棕黃色顆粒，偶見胞核中亦有表達(dá)(圖1～3)。炎癥組中MK的表達(dá)主要集中于棘細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層(圖2)。恢復(fù)組中MK的表達(dá)主要集中于棘細(xì)胞層和基底細(xì)胞層(圖3)。正常對(duì)照組中MK的表達(dá)較少(圖1)。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示:炎癥組以弱陽(yáng)性為主，恢復(fù)組以強(qiáng)陽(yáng)性和中強(qiáng)陽(yáng)性為主;正常對(duì)照組大部分為陰性，僅2例為弱陽(yáng)性。經(jīng) χ2檢驗(yàn)，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(表1)。

表1 各組MK表達(dá)程度比較

圖1 MK在正常對(duì)照組牙齦組織中表達(dá)的免疫組化染色(×40)

圖2 MK在炎癥組牙齦組織中表達(dá)的免疫組化染色(×40)

圖3 MK在恢復(fù)組牙齦組織中表達(dá)的免疫組化染色(×40)

2.2 Western-blotting免疫檢測(cè)

用Western-blotting方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行MK蛋白表達(dá)的檢測(cè)，可見在分子量為15 kDa處有蛋白條帶出現(xiàn)(圖4)。

圖4 恢復(fù)組和炎癥組MK蛋白電泳結(jié)果

BANDLEADER軟件掃描分析各條帶的光密度值(表2)顯示:恢復(fù)組MK表達(dá)量明顯高于炎癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 炎癥組與恢復(fù)組MK表達(dá)量比較 (A值)

3 討論

MK作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子可以誘導(dǎo)人皮膚纖維母細(xì)胞分泌膠原蛋白，是一種有效的膠原和粘多糖分泌刺激劑，對(duì)刺激傷口愈合有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn):當(dāng)皮膚燒傷后，MK陽(yáng)性細(xì)胞開始浸潤(rùn)皮下結(jié)締組織，燒傷后2 d此區(qū)域中MK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰，之后迅速減少，蛋白印跡法顯示這些MK為30 kDa的二聚體［3］。MK在正常完整的胃腸道，特別是黏膜下層和肌層中有表達(dá)，主要位于細(xì)胞的基底膜中。有學(xué)者觀察急性和慢性胃黏膜損傷的大鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn):在慢性纖維母細(xì)胞反應(yīng)修復(fù)胃潰瘍過(guò)程中，MKm-RNA表達(dá)持續(xù)增高，而且慢性纖維母細(xì)胞系MRC-5MK表達(dá)強(qiáng)烈，提示在深層潰瘍修復(fù)過(guò)程中MK對(duì)成纖維細(xì)胞增生有促進(jìn)作用;在心肌梗塞的早期也有MK的表達(dá)，表明MK對(duì)心肌的修復(fù)有促進(jìn)作用［4］。

MK與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，可以通過(guò)誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組織胺引起炎癥反應(yīng)，同時(shí)還可通過(guò)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的活性誘發(fā)人中性粒細(xì)胞趨化作用。MK在類風(fēng)濕、骨關(guān)節(jié)炎等疾病中通過(guò)中性粒細(xì)胞也起作用［5］。有研究發(fā)現(xiàn)MK在實(shí)驗(yàn)性視覺損傷的模型中，能夠減少損傷。即利用強(qiáng)光持續(xù)照射，造成實(shí)驗(yàn)性視覺損傷，同時(shí)在玻璃體內(nèi)注射MK，1周后發(fā)現(xiàn):注射MK的視網(wǎng)膜外核層厚度和視覺電位與對(duì)照組差異顯著，并且能使損傷的視神經(jīng)得到修復(fù)［6］。

牙周炎是一種慢性感染性疾病，微生物與宿主的相互作用決定了疾病的過(guò)程和進(jìn)展。微生物可以通過(guò)自身代謝產(chǎn)物引起組織破壞，直接發(fā)揮致病作用，或通過(guò)刺激和改變宿主反應(yīng)間接起致病作用。隨著對(duì)牙周病發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步了解，現(xiàn)已經(jīng)清楚地認(rèn)識(shí)到牙周病的大多數(shù)組織損害是由于宿主對(duì)感染的應(yīng)答引起的。MK不僅與生理功能有關(guān)，還與炎癥、創(chuàng)傷、修復(fù)等有關(guān)，但其在口腔牙周炎中的表達(dá)研究尚未見到相關(guān)報(bào)道。

本研究首先采用免疫組化方法對(duì)MK進(jìn)行了定性研究，明確MK主要定位于齦上皮、溝內(nèi)上皮和結(jié)合上皮細(xì)胞的胞漿中，其主要定位于牙齦上皮組織而非結(jié)締組織中。同時(shí)定量分析發(fā)現(xiàn):恢復(fù)組組織中MK表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于炎癥組。炎癥組中MK的表達(dá)主要為弱陽(yáng)性、中強(qiáng)陽(yáng)性;恢復(fù)組中MK的表達(dá)多呈強(qiáng)陽(yáng)性或中強(qiáng)陽(yáng)性，提示:MK在牙周炎發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中既有致炎作用，又有促進(jìn)組織恢復(fù)的作用，在炎癥進(jìn)行過(guò)程中主要參與致炎，而在治療后其促進(jìn)組織恢復(fù)的作用更明顯，也就是MK在炎癥組織恢復(fù)愈合中發(fā)揮的功能更顯著。

Western-blotting印跡法主要應(yīng)用于某些特定蛋白質(zhì)的鑒別和定量，由于其具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，可以檢測(cè)出1～5 ng中等大小級(jí)別的待測(cè)蛋白。本研究運(yùn)用Western-blotting方法對(duì)炎癥組和恢復(fù)組牙齦組織中的MK進(jìn)行了定量分析，比較二者M(jìn)K蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在治療后恢復(fù)組中MK的表達(dá)量明顯高于治療前炎癥組，進(jìn)一步說(shuō)明其具有顯著促進(jìn)組織恢復(fù)作用，與免疫組化研究結(jié)果基本一致。

本結(jié)果可見兩種方法檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)結(jié)果是一致的，Western-Blotting免疫印跡具有直觀性，免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)更為微觀的表達(dá)，而且將表達(dá)準(zhǔn)確定位。所得結(jié)果初步為牙周炎癥性疾病發(fā)病因素的研究、臨床診斷、預(yù)后觀察等臨床和基礎(chǔ)工作提供了有一定參考價(jià)值的信息，但MK在組織中具體致炎和促進(jìn)組織恢復(fù)的作用機(jī)制還有待于更深入的研究。

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