年齡因素對人牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)和性能的影響

張 璟，楊 昊，高麗娜，安 瑩，陳發(fā)明，金 巖

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710032)

牙周病是一種以破壞牙周支持結(jié)構(gòu)，并最終導(dǎo)致牙齒脫落的慢性進(jìn)展性疾病。據(jù)不完全統(tǒng)計:美國有大約30%～40%的成年人患有不同程度的牙周疾病，在我國中老年人群中慢性牙周炎的發(fā)病率甚至高達(dá)70%，牙周炎的防治面臨嚴(yán)峻的形勢和挑戰(zhàn)［1］。傳統(tǒng)牙周治療方法例如超聲潔治、齦下刮治、翻瓣術(shù)，以及近年來廣泛開展的Vector治療、各種骨移植術(shù)等，都沒有達(dá)到預(yù)期的治療效果，特別是不能實現(xiàn)牙周組織的生理和功能性再生［2－4］。組織工程研究為牙周病的治療和牙周缺損的修復(fù)開辟了新的研究空間，特別是利用自體(智齒、正畸拔除的牙齒)來源的牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)治療牙周組織喪失在動物體內(nèi)取得了令人振奮的結(jié)果［5］，甚至有學(xué)者已經(jīng)開始臨床病例的嘗試［6］。然而目前開展的基礎(chǔ)和臨床研究中，多數(shù)沒有考慮到年齡因素對PDLSCs培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的影響。本研究通過不同年齡智齒中牙周膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和對比分析，觀察＞50歲PDLSCs的生物學(xué)性能是否與＜30有明顯差異，為PDLSCs的應(yīng)用研究是否要考慮年齡因素提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清FBS(四季青公司);α－MEM培養(yǎng)基、L－谷氨酰胺、青鏈霉素(Gibco，美國);2.5 g/L胰蛋白酶(Amresco，美國);Dispase(Roche，美國);I型膠原酶、地塞米松、β－甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅、油紅 O(Sigma，美國);抗 CD29、抗CD31、抗 CD34、抗 CD44、抗 CD90、抗 CD105、抗CD146、抗 STRO－1 抗體(R＆D Systems，美國);50 g/L、90 g/L、170 g/L EDTA(Pulpdent，美國);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國);離心機(jī)(Kubota2l00，日本);YJ－875 型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠);倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)(IX70)、體視顯微鏡(Olympus，日本);6孔培養(yǎng)板、平底 96孔板(Falcon，美國);流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA，美國);超聲震蕩儀(上海生源器械廠)。

1.2 人牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)

人牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［7］方法。分別選取無全身性疾病的＜30歲和＞50歲志愿者因阻生拔除的第三磨牙各4例，拔除后立即用PBS液沖洗3遍后，刮取根中1/3區(qū)域的牙周膜組織，切割成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，0.01 mol/L PBS液沖洗后，移入離心管內(nèi)，以1∶1比例加入3 mg/mL的I型膠原酶和4 mg/mL的Dispase的混合液2 mL，37℃培養(yǎng)箱消化15 min。然后再將組織塊以5 mm的間隔平整放于6孔板中，上置蓋玻片，滴加含100 mL/L胎牛血清的α－MEM培養(yǎng)基，在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，每2～3 d半量換液。待細(xì)胞從組織塊邊緣爬出并生長匯合達(dá)80%時，用2.5 g/L胰酶或1 g/L EDTA，pH=6.4消化傳代7～10 d。

1.3 有限稀釋法克隆化培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞

收集上述培養(yǎng)上清1500 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm直徑的小濾器過濾后，與培養(yǎng)基以1∶1比例混合作為適應(yīng)性培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的第1代細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至10～15/mL，吹打混勻接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h后標(biāo)記單個細(xì)胞孔，并補(bǔ)液至每孔200 μL，5 d換液，待克隆長至孔底1/3～1/2后2.5 g/L胰蛋白酶消化，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞克隆形成能力

取生長良好的第3代細(xì)胞，以1×103的密度接種于9 cm的培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)，鏡下觀察培養(yǎng)皿內(nèi)克隆情況，14 d終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用PBS浸洗2次加40 g/L多聚甲醛液固定15 min，棄去固定液，加適量甲苯胺藍(lán)染色15 min，PBS浸洗2次，以不少于50個細(xì)胞的集落計為一克隆，并按照下列公式計算克隆形成率。

1.5 MTT法檢測生長曲線

取不同年齡段人PDLSCs胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以1.5×103個接種于96孔板，每孔加入含100 mL/L FBS 的 α－MEM 培養(yǎng)液180 μL，37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。分別于培養(yǎng)后1、2、3、4、5、6、7 d 各取一組細(xì)胞，于每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。然后，吸去培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜液，在振蕩器中震蕩10 min后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測每孔490 nm波長吸光(OD)值。實驗重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子

取不同年齡段第5代 PDLSCs調(diào)整至細(xì)胞密度1×106/mL，40 g/L多聚甲醛固定15 min;PBS洗滌2次，分別加入兔抗鼠 STRO－1、CD146和CD105單抗，室溫孵育60 min;洗滌后分別加入羊抗兔Ig－FITC，室溫避光45 min;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面 CD29、CD44、CD90、CD105、CD34、CD31、STRO－1，CD146的表達(dá)水平。

1.7 PDLSCs成脂能力鑒定

取不同年齡段第5代PDLSCs，以5×104/mL的密度接種于6孔板，細(xì)胞擴(kuò)增至90%左右時，加脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液(含 1 μmol/L DEC、0.5 mmoL/L IBMX、10 rng/L BPE、100 mmoL/L Indomethacin、100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d換液1次。培養(yǎng)14 d后，棄原液，PBS沖洗，40 g/L多聚甲醛，油紅O染色鏡下觀察。成脂分化染色后用異丙醇洗脫油紅O，在510 nm波長下測定OD值，以之作為成脂分化的定量值。

1.8 PDLSCs成骨能力鑒定

取不同年齡段第5代PDLSCs，以5×104/mL的密度接種于6孔板，待細(xì)胞擴(kuò)增至60%左右時，更換礦化誘導(dǎo)液 (含10 mmoL/L β－甘油磷酸鈉、50 μg/mL 維生素 C、1×10－8moL/L 地塞米松、50 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)21 d。鏡下觀測到細(xì)胞聚集并出現(xiàn)圓形結(jié)節(jié)時，棄誘導(dǎo)液，去離子水漂洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，茜素紅染色鏡下觀察。成骨分化染色后，洗脫茜素紅，在562 nm波長下測定OD值，并對每個培養(yǎng)孔細(xì)胞做蛋白定量，以茜素紅OD值與蛋白定量值的比值作為成骨分化的定量值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 牙周膜干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

本研究采用消化法培養(yǎng)原代細(xì)胞，細(xì)胞以組織塊為中心向周邊擴(kuò)展，＜30歲組3～7 d均有大量細(xì)胞長出，而＞50歲組最晚，10 d才有細(xì)胞爬出組織塊;細(xì)胞相互接觸匯合成片達(dá)80%時間＜30歲組平均12 d，＞50歲組18 d。傳代后細(xì)胞大多數(shù)呈長梭形或短梭形，生長快慢不等，匯合后呈漩渦狀生長，胞體豐滿，缺乏細(xì)長突起，相當(dāng)數(shù)目為三角形或是多角形，但都表現(xiàn)為胞核聚集在中心，胞質(zhì)形成的突起向外呈放射狀，具有成體干細(xì)胞的特征(圖1)。單克隆挑選培養(yǎng)14 d后，細(xì)胞克隆形成能力＜30歲組為(31.1±0.926)%，＞50歲組為(10.3±0.912)%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)(圖2)。

圖1 牙周膜干細(xì)胞原代培養(yǎng)光鏡照片(14 d，×40)

圖2 單細(xì)胞克隆培養(yǎng)光鏡照片(14 d，×20)

圖3 MTT法檢測細(xì)胞生長曲線

2.2 PDLSCs生長情況

MTT法檢測見＞50歲組細(xì)胞生長相對緩慢，與＜30歲組相比除第1天外，其他各時間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)。

2.3 流式細(xì)胞分析結(jié)果

＜30歲與＞50歲組牙周膜干細(xì)胞表面分子的表達(dá)相似，均陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記 CD29、CD44、CD90、CD105、CD146、STRO －1，陰性表達(dá)造血系細(xì)胞特異性分子CD34和內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子CD31(圖4)。

圖4 流式細(xì)胞儀檢查結(jié)果

2.4 PDLSCs成脂、成骨能力比較

經(jīng)成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)至第10天左右，可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，較培養(yǎng)初期更為飽滿，至14 d時油紅O染色陽性，細(xì)胞胞漿內(nèi)有脂滴形成(圖5)，成脂量化分析顯示，＜30歲組為0.898%，＞50歲組為0.398%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)8 d后，細(xì)胞呈復(fù)層生長，局部增厚，12 d左右中央出現(xiàn)許多顆粒樣改變，并逐漸連接成片，密度增高。21 d左右孔板底部出現(xiàn)肉眼可見針尖大小灰白色小結(jié)節(jié)，并逐漸增大，茜素紅染色可見紅色礦化結(jié)節(jié)(圖6)。成骨量化分析顯示 ＜30歲組為1.11%，＞50歲組為0.64%，兩組差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖5 體外成脂誘導(dǎo)光鏡照片(14 d，×100)

圖6 體外成骨誘導(dǎo)光鏡照片(21 d，×100)

3 討論

目前牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)基本成熟，利用自體來源干細(xì)胞治療牙周病的研究一直是熱門課題［5－8］。以往研究中，年齡因素對牙周膜干細(xì)胞性能的影響報道不多，特別是50歲以上的患牙牙周膜中是否仍然存在足夠數(shù)目的干細(xì)胞、其增殖分化能力是否與年輕牙周膜干細(xì)胞有顯著差異，尚未見報道。

本結(jié)果顯示:＞50歲病人來源的第三磨牙牙周膜中仍然存在PDLSCs，并具有基本的牙周膜干細(xì)胞特性，但與＜30歲組相比，其增殖與分化能力相對較弱。Nagatomo 等［9］(2006)發(fā)現(xiàn):PDLSCs表達(dá) 細(xì) 胞 表 面 抗 原 CD105、CD166、STRO－1。Ivanovski等［10］(2001)發(fā)現(xiàn):PDLSCs或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞均無CD14、CD45、CD34表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn):＜30歲組和＞50歲組來源的PDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記均陽性表達(dá)，而在造血系表面標(biāo)記陰性表達(dá)，但＜30歲組陽性率略低于50歲以上組(未進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析)。成骨、成脂能力體外誘導(dǎo)實驗結(jié)果表明:隨著年齡增加，人PDLSCs多向分化能力減弱，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致［11］。因此，在未來人PDLSCs的應(yīng)用和轉(zhuǎn)化研究中，應(yīng)充分考慮到年齡因素對干細(xì)胞性能產(chǎn)生的影響［12－13］。本研究的進(jìn)一步深入探索，應(yīng)擴(kuò)大樣本資料，對不同年齡組來源的人PDLSCs的相關(guān)特性進(jìn)行研究，并對不同組細(xì)胞的基因表達(dá)差異進(jìn)行對比分析，以期獲得更有價值的數(shù)據(jù)資料。

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