變異鏈球菌乳酸脫氫酶與霍亂毒素B亞單位嵌合表達質粒的構建和表達

張 燕，劉建國，陳 筑，馬欣榮，唐 琳，吳家媛，張 劍，管曉燕

(1.遵義醫學院附屬口腔醫院，貴州遵義 563003;2.中國科學院成都分院生物研究所，四川成都6100413.濱州醫學院附屬醫院口腔內科，山東濱州 256603)

變異鏈球菌(簡稱變鏈菌)是公認的主要致齲菌。變鏈菌利用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)發酵碳水化合物產生酸性代謝物，導致生物膜環境pH值降低，是齲病發生的直接原因［1－2］。本研究采用分子生物學技術，將 LDH 編碼基因ldh和免疫佐劑霍亂毒素B亞單位(CTB)編碼基因ctxB克隆到原核表達載體pET32a(+)上，并誘導表達融合蛋白，為下一步構建含該嵌合基因的植物真核表達載體奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

變鏈菌臨床分離株(血清型C，四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室齲病研究室劉天佳教授惠贈);E.coli JM109(四川大學生命學院張義正教授惠贈);pET32a(+)(四川大學生命學院張仁懷博士惠贈);pBSK－ctxB(中國科學院上海生物化學研究所吳祥甫教授惠贈);E.coli BL21(Promega公司);細菌基因組DNA提取試劑盒、小量質粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(V－gene公司);DNA連接試劑盒、限制性內切酶KpnⅠ、SacⅠ、XhoⅠ(TaKaRa生命技術工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 變鏈菌培養和基因組DNA的提取

37℃微需氧培養變鏈菌至飽和狀態，以細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 LDH 編碼基因 ldh的獲得

以基因組DNA為模板，根據GS－5全序列(GeneBank accession number M72545)設計引物擴增ldh。引物序列:p1:5'－GCG GGT ACC ATG ACT GCA ACT AAA CAA CA－3';p2:5'－GCA GAG CTC GGA TCC GCC GTT ACG AGC TGC AGC AAA T－3'。PCR反應體系:ddH2O 37.8 μL，10 × buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，p11 μL，p21 μL，rTaq 0.2 μL，模板1 μL。共計50 μL。反應條件為:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火45 s;72℃延伸2 min;以上條件反應循環35次，72℃延伸7 min;4℃保存。5 μL PCR擴增產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠檢測。使用PCR產物回收試劑盒回收全部產物。

1.2.3 質粒 pET－LDH 的構建

將目的基因ldh和載體pET32a(+)以KpnⅠ和SacⅠ雙酶切后連接。體系如下:pET32a(+)雙酶切純化產物0.5 μL，目的基因雙酶切純化產物4.5 μL，ligation solutionⅠ5 μL，總體積 10 μL?；靹蚝?6℃連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞。挑取陽性重組子提質粒酶切鑒定。

1.2.4 ctxB 基因的獲得

以質粒pBSK－ctxB為模板，根據文獻報道［2］設計引物擴增 ctxB，引物序列如下:p3:5’－GCG GAG CTC GGC TCT GGT GGC TCT GGA TCT ATT AAA TTA AAA TTT GGT GTT TT －3';p4:5'－GCC CTC GAG TTA ATT TGC CAT ACT AAT TG－3'。反應體系 ddH2O 37.8 μL，10 × buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，p31 μL，p41 μL，rTaq 0.2 μL，模板 1 μL，共計50 μL。循環條件為:94℃預變性5 min;94℃變性45 s;58℃退火30 s;72℃延伸1 min;以上條件反應循環 35次，72℃延伸7 min，4℃保存。5 μL PCR擴增產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠檢測。使用PCR產物回收試劑盒回收全部產物。

1.2.5 質粒 pET－LDH/CTB 的構建

將目的基因 ctxB和 pET－LDH以 SacⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接。體系如下:pET－LDH雙酶切純化產物 0.5 μL，目的基因雙酶切純化產物4.5 μL，ligation solutionⅠ 5 μL，總體積 10 μL?；靹蚝?6℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞。挑取陽性重組子提質粒酶切鑒定。質粒pET－LDH/CTB送上海聯合基因公司對插入基因進行序列測定。

1.2.6 誘導表達

質粒 pET－LDH/CTB轉化 E.coli BL2l(DE3)，加入IPTG，37℃誘導4 h，以SDS－PAGE電泳檢測。

2 結果

2.1 基因ldh的 PCR擴增

擴增PCR產物電泳條帶呈單一條帶，特異性高，大小約1 kb，與預計大小相符(圖1)。

2.2 質粒pET－LDH酶切鑒定

重組質粒pET－LDH經KpnⅠ單酶切后得到約6.9 kb大的單一片段;經KpnⅠ和SacⅠ雙酶切后得到大小約5.9 kb和1.0 kb的兩個片段(圖2)。

2.3 基因ctxB的 PCR擴增

PCR產物電泳結果顯示為單一條帶，特異性高，大小約390 bp，與預計相同(圖3)。

2.4 質粒pET－LDH/CTB的酶切鑒定

重組質粒pET－LDH/CTB經SacⅠ單酶切后得到約7.3 kb大小的單一片段;經KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到大約5.9 kb和1.4 kb的兩個片段;以KpnⅠ和SacⅠ雙酶切后得到約6.3 kb和1.0 kb大小的兩個片段;以SacⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到約6.9 kb和0.4 kb大小的兩個片段(圖4)。

2.5 質粒pET－LDH/CTB的序列測定和分析

重組質粒 pET－LDH/CTB中插入嵌合基因1390 bp。質粒pET－LDH/CTB中插入的ldh序列與Gene Bank中ldh比較同源性98%，插入的ctxB與Gene Bank中ctxB比較同源性達99%。在插入基因的上游，即KpnⅠ酶切位點的3’端為啟始密碼子ATG，在插入基因的下游，即XhoⅠ酶切位點的5’端為終止密碼子TAA。

2.6 融合蛋白的誘導表達和表達產物SDS－PAGE鑒定

結果表明:表達菌株 BL/pET－LDH/CTB經IPTG誘導4 h后表達融合蛋白，融合蛋白的分子量約70×103(圖5)。

圖1 變鏈菌ldh PCR

圖2 質粒pET－LDH酶切鑒定

圖3 ctxB PCR擴增

圖4 質粒pET－LDH/CTB酶切

圖5 BL/pET－LDH/CTB表達產物的SDS－PAGE

3 討論

pET表達系統是有史以來在E.coli中克隆表達重組蛋白功能最強大的系統之一。目的基因被克隆到pET32a(+)載體上，受T7噬菌體強轉錄和翻譯信號控制，并通過在宿主細胞提供T7 RNA聚合酶來誘導表達。pET表達系統使用最廣泛的為宿主菌 BL21(DE3)及其衍生菌株［3］。pET32a(+)帶有氨芐青霉素抗性基因，以及可供選擇的His.tag、S.tag 、Trx.tag 標簽，利用這些標簽可以設計表達融合蛋白以利于蛋白的分離純化［4］。當目的基因被人為的克隆致pET載體的多克隆位點(T7 lac強啟動子的下游)后，宿主菌在代謝性乳糖類似物IPTG的誘導作用下能產生大量的T7RNA聚合酶，后者特異性的識別表達載體中核糖體結合位點，從而高效表達目的重組蛋白。由于IPTG不會被宿主菌利用，因此向培養液中加入少量的IPTG就能對lacUV5和T7 lac強啟動子產生持久的誘導作用。本研究中將已構建的嵌合基因表達質粒pET－ldh－ctxB 轉化 E.coli BL2l(DE3)，經IPTG誘導表達了融合蛋白質。

LDH是合成乳酸的關鍵酶，作為變鏈菌的重要毒力因子之一，其生物學作用是致齲的關鍵環節。變鏈菌LDH蛋白分子量為35×103，由328個氨基酸組成，分子量與其他產乳酸菌的LDH相近且氨基酸序列具有較高同源性。LDH的活性編碼區大小為1.2 kb，加上相關調節序列共1.29 kb，存在多個酶切位點。堿基1～255 bp是核糖體結合和啟動子區域，256～1239 bp為編碼活性區，其后是由兩個反相重復序列構成的非依賴性終止子區域。已有研究證實變鏈菌LHD具備全套轉錄、翻譯基原，為獨立調節基因［2，5］。不同種屬的LDH活性中心、結構和配體作用動力學參數極為相似，有著相同的FDP(1，6－二磷酸果糖)激活機制并存在較強的免疫交叉反應。目前變鏈菌LDH在齲病防治中的應用研究主要是替代療法。有學者通過基因重組構建了效應株BCS3－L1，經體外發酵實驗、嚙齒類動物試驗、基因穩定性和對宿主健康影響的研究，證實菌株發酵各種碳源的產物以乙醇和乙酰甲基醇代替了乳酸，在限菌大鼠和傳統SD大鼠口腔中的競爭和定植較對照組強，牙面各級齲病計分均較對照組低［2，6］。乳酸脫氫酶蛋白作為抗原具有免疫原性，本研究選取編碼LDH蛋白的全序列作為構建嵌合體防齲疫苗的目的基因。

口服疫苗主要通過黏膜途徑誘導機體產生保護性抗體，其最大缺陷是所需抗原劑量大和易對抗原產生免疫耐受，需免疫佐劑的輔助［7－8］。近年來在防齲疫苗方面研究較多也較為成熟的主要是霍亂毒素和CTB。CTB本身不具有毒性，具有很強的免疫原性，通過口服能使機體產生很高的抗體效價，能輔佐其他抗原刺激機體產生SIgA和血清型IgG，因此可以作為黏膜免疫佐劑或給藥的導向分子，特別是當其經化學方法或基因融合技術使其與不相關抗原形成偶聯蛋白或融合蛋白時，其免疫佐劑活性強于其與不相關抗原混合免疫時的佐劑活性［8－10］。許多研究者通過基因重組技術獲得ctxB與目的抗原的融合蛋白從而達到增強特異性抗原的免疫原性的目的［11－14］。本課題組在前期構建了攜帶變鏈菌表面蛋白PAcA和CTB嵌合基因的植物表達質粒，利用農桿菌介導法轉化番茄，獲得表達嵌合蛋白PAcA/CTB的轉基因番茄，并進行了動物免疫實驗和生態安全性的評價研究證實表達的嵌合蛋白PAcA/CTB具有很好的免疫原性，能夠誘導動物產生特異性的黏膜免疫應答和系統免疫應答［15］。因此本研究選用CTB作為黏膜免疫佐劑，以提高變鏈菌乳酸脫氫酶的免疫原性。

［1］Dong YM，Pearce EIF，Yue L，et al.Piaque pH and associated parameters in relation to caries［J］.Caries Res，1999，33(4):428－436.

［2］楊德琴，劉天佳.變形鏈球菌乳酸脫氫酶的結構及應用［J］.國外醫學口腔醫學分冊，2003，30(3):203 －205.

［3］Mitraki A，King J.Protein folding intermediates and inclusion body formation［J］.Biotechnology，1989，7(6):690 －697.

［4］J薩姆布魯克，DW拉塞爾.《分子克隆實驗指南》［M］.黃培堂，譯.3版.北京:科學出版社，2002:1217－1265.

［5］楊德琴，劉天佳，莊恒，等.變形鏈球菌臨床分離株乳酸脫氫酶遺傳多態性研究［J］.四川大學學報(醫學版)，2006，37(5):781－784

［6］林靜，朱明，李新尚，等.沒食子鞣質及聯合氟化鈉對不同狀態下變形鏈球菌乳酸脫氫酶活性影響的研究［J］.口腔醫學，2011，31(5):257－260

［7］Yamamoto M，McGhee JR，Hagiwara Y，et al.Genetically manipulated bacterial toxin as a new generation mucosal adjuvant［J］.Scand J Immunol，2001，53(3):211 －217.

［8］Isaka M，Yasuda Y，Taniguchi T，et al.Mucosal and systemic antibody responses against an acellular pertussis vaccine in mice after intranasal co－administration with recombinant cholera toxin B subunit as an adjuvant［J］.Vaccine，2003，21(11 － 12):1165－1173.

［9］嚴小芳，張佩，董碩.霍亂毒素無毒B亞單位(CTB)黏膜免疫佐劑的研究進展［J］.生命科學，2009，21(1):53－55.

［10］Dertzbaugh MT，Peterson DL，Macrina FL.Cholera toxin B subunitgene fusion:structural and functional analysis of the chimeric proterin［J］.Infect Immun，1995，63(10):2021 －2025.

［11］張任飛，楊致邦，周俠，等.幽門螺桿菌vacA－ctxB融合基因原核表達載體的構建［J］.重慶醫科大學學報，2009，34(1):37－40.

［12］Habarta A，Patricia AE，Olivera N，et al.Increased immunogenicity to LipL32 of Leptospira interrogans when expressed as a fusion protein with the cholera toxin B subunit［J］.Curr Microbiol，2011，62:526 －531.

［13］Prabakaran M，Velumani S，He F，et al.Protective immunityagainst influenza H5N1 virus challenge in mice by intranasalcoadministration of baculovirus surface－displayed HA and recombinant CTB asan adjuvant［J］.Virology，2008，380:412 －420.

［14］Odumosu O，Nicholas D，Payne K，et al.Cholera toxin B subunit linked to glutamic acid decarboxylase suppresses dendritic cell maturation and function［J］.Vaccine，2011，IN PRESS.

［15］白國輝，劉建國，田源，等.防齲用轉基因番茄生態安全性的評價研究［J］.牙體牙髓牙周病學雜志，2011，21(5):245－249.