Bcl－2在成釉細胞分化、分泌過程中的表達研究

于西佼，唐開亮，杜 毅，李 紓

(山東 濟南 250001:1.濟南市口腔醫院牙體牙髓科;2.山東大學省口腔生物醫學重點實驗室)

Bcl－2是目前已被確認的凋亡調控抑制蛋白，Tsujimoto等［1］(1984)從人14號和18號染色體易位的濾泡性淋巴瘤中分離出的一種原癌基因，編碼Mr 26000蛋白，分布于線粒體內膜、細胞膜、細胞核膜和內質網膜上。Bcl－2可促進細胞的存活而減少凋亡的發生，抑制多種基因誘導的細胞凋亡，并在不影響細胞增殖的情況下增強細胞存活力，參與細胞增殖和凋亡動態平衡的調控。

本研究通過制備不同發育階段的BALB/C小鼠下頜第一磨牙牙胚標本，采用TUNEL法和PV免疫組織化學技術檢測凋亡調控抑制蛋白Bcl－2在成釉細胞分化、分泌過程中的表達;透射電鏡觀察細胞超微結構的變化，以期探討Bcl－2和細胞凋亡在該過程的可能作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

鼠PCNA單克隆抗體、PV免疫組化兩步法試劑盒、DAB顯色劑(北京中杉);多聚賴氨酸(Sigma美國);RM2135切片機(LEICA，德國);OLYMPUS CX71顯微鏡和照相系統、JEM－1200EX透射電鏡(日本)。

1.2 標本制備

取出生后 2、5、7、9、14 d 不同發育階段的BALB/C小鼠下頜第一磨牙牙胚(山東大學動物中心提供)25只，分別于麻醉后用新鮮配置的40 g/L多聚甲醛內固定，解剖分離下頜骨，40 g/L多聚甲醛 4℃下再固定1 d、100 g/L EDTA脫鈣1～2個月，梯度乙醇脫水、石蠟包埋，近中遠中向5 μm連續切片，行HE和免疫組化。

1.3 免疫組化

采用PV免疫組化法對Bcl－2表達進行組織定位。常規石蠟切片脫蠟、水化至水，30 mL/L過氧化氫液室溫孵育10 min以滅活內源性過氧化物酶活性，滴加Bcl－2單克隆抗體(1∶100稀釋)，37℃溫箱孵育1 h。PBS洗2 min×3次，滴羊抗鼠IgG抗體－HRP多聚體，37℃孵育20 min，PBS漂洗，DAB液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染30 s，常規脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并照相。(陽性表達呈棕黃色)。陰性對照片用PBS分別代替一抗或二抗，以成骨肉瘤組織作陽性對照。

1.4 原位末端標記(TdT－mediated－dUTP nick end labeling，TUNEL)法檢測細胞凋亡

石蠟切片常規脫蠟、水化至水，30 mL/L過氧化氫液溫處理7 min以滅活內源性過氧化物酶。DDW(double distilled water)沖洗，0.1 mol/L PBS液(pH 7.4)2 min × 3 次;用 16.2 μg/mL 蛋 白 酶 K(10 mmol/L Tris/HCI pH 7.4)在37℃溫箱孵育消化10 min，DDW沖洗，PBS洗2 min ×3次;每個標本加入20 μL的TUNEL反應液(1號液與2號液按1∶9混合配制，1號液為末端脫氧核酸轉移酶TdT，2號液為核苷酸混合液)放于濕盒中37℃ 溫箱孵育60 min，DDW沖洗，PBS洗2 min ×3次;此時在熒光顯微鏡下觀察并分析結果后，加入酶標記的抗熒光素抗體轉化劑－POD(3號液)，濕盒內37℃溫箱孵育30 min，DDW沖洗，PBS洗2 min ×3次;正常山羊血清室溫處理10 min以減少非特異性結合，PBS洗 2 min×3次;加入DAB顯色劑鏡下顯色，DDW終止顯色反應，沖洗，蘇木精復染30 s，自來水沖洗5 min，常規脫水封片，鏡下觀察并照相。以2號液代替TUNEL反應液作陰性對照。

1.5 透射電鏡觀察

將分離的含下頜第一磨牙區的下頜骨于25 mL/L戊二醛固定液中4℃下初固定2 d，初步修剪標本，100 g/L EDTA 脫鈣1 周，0.1 mol/L PBS 液(pH 7.4)沖洗后10 g/L 鋨酸后固定2 h，經梯度乙醇(300、500、700、850、950 mL/L無水乙醇×3次)脫水后，換環氧乙烷過渡(環氧乙烷:包埋劑 =3∶1、1∶1、1 ∶3 及純包埋劑浸透)，逐步過渡到Spurr包埋劑中包埋，然后升溫聚合、修塊切片，堿性品紅－亞甲藍染色1～2 min，水沖后，顯微鏡下觀察定位，進一步修塊后，80 nm超薄切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重染色，JEM－1200EX透射電鏡觀察并拍照。

2 結果

小鼠出生后第2、5天，成釉細胞處于分化期，內釉上皮分化成為成釉上皮，細胞器重新定位，細胞核逐漸遠基底膜排列，超微結構可見胞漿內有高爾基復合體和線粒體(圖1)，可觀察到成釉細胞增生的核分裂(圖2);免疫組化結果顯示Bcl－2陽性表達(圖3)，TUNEL檢測結果發現部分細胞胞核陽性表達，提示有細胞凋亡的存在(圖4)。

小鼠出生后第7、9天處于分泌期，成釉細胞已開始分泌，可見新形成的釉質，胞核遠基底排列，胞核附近可見大量線粒體，胞質內可見大量高爾基復合體和粗面內質網(圖5)。胞漿呈Bcl－2強陽性表達(圖6);TUNEL檢測發現有少量成釉細胞胞核陽性表達(圖7)。

出生后第14天釉質發育完成，成釉細胞變短，細胞間隙變大，細胞器數量減少，核膜逐漸不清，異染色體增加，核糖體脫顆粒水腫，呈現凋亡征象(圖8)，胞漿則未見Bcl－2陽性表達(圖9)。

圖1 成釉細胞分化期，胞核大，胞漿可見到高爾基復合體和線粒體(透射電鏡，×3000)

圖2 成釉細胞分化期，細胞可見核分裂征象(透射電鏡，×3000)

圖3 出生后第2天，成釉細胞分化期，內釉上皮細胞胞核尚未遠基底排列，細胞呈Bcl－2陽性表達(免疫組化，×20)

圖4 出生后第5天，成釉細胞分化期，胞核開始遠基底排列，TUNEL檢測結果發現部分成釉細胞胞核陽性表達(×40)

圖5 出生后第7天，成釉細胞分泌期，胞質內可見大量線粒體、高爾基復合體和粗面內質網(透射電鏡，×3000)

圖6 出生后第9天，成釉細胞分泌期，細胞胞質呈棕黃色，Bcl－2陽性表達(免疫組化，×20)

圖7 出生后第7天，成釉細胞分泌期，釉質開始形成，胞核遠基底排列，TUNEL檢測結果發現部分成釉細胞胞核呈棕黃色，可見細胞凋亡陽性表達(×40)

圖8 出生后第14天，釉質發育完成，細胞器數量減少，核膜逐漸不清，異染色體增加(透射電鏡，×3000)

圖9 出生后第14天，釉質發育完成，細胞變短，細胞呈Bcl－2陰性表達(免疫組化，×20)

3 討論

在胚胎發育中，組織發育總是在細胞遷移、誘導、增殖和凋亡變化中完成，并處于動態的平衡。細胞凋亡(apoptosis)又稱編程性細胞死亡(programmed cell death，POD)，是生命過程中不可缺少的一種細胞自我調節機制和多細胞生物藉以生存的重要細胞代謝方式，在組織形態發生過程中起到重要的塑型作用，是機體維持細胞群體數量穩定的重要手段［2］。Bronckers 等［3］研究證實，細胞凋亡可存在于釉質發育的各個階段，包括成釉細胞的分化期、分泌期、轉變期等。

本研究中觀察到處于分化期、分泌期的成釉細胞中都呈Bcl－2陽性表達，并在釉質分泌的高峰期即小鼠出生后第9天呈強陽性表達。在分化期，內釉上皮逐漸分化為成釉上皮，為分泌期做細胞準備，超微結構觀察可見明顯的細胞核分裂，此時細胞增殖分化活躍，而且TUNEL檢測發現部分細胞胞核陽性表達，提示細胞凋亡的同時存在;Bcl－2的陽性表達則表明其參與成釉細胞分化期的細胞凋亡調控。Bcl－2可促進細胞的存活而減少凋亡的發生，抑制多種基因誘導的細胞凋亡，平衡細胞增殖和凋亡。分泌期是釉質發育的最關鍵階段，超微結構觀察發現成釉細胞內有大量參與蛋白合成的高爾基復合體、粗面內質網以及提供細胞能量的線粒體，表明細胞分泌功能活躍。但TUNEL檢測結果發現分泌期部分細胞胞核呈陽性表達，說明此階段也存在細胞凋亡;而且此階段成釉細胞對Bcl－2的陽性表達增強，提示Bcl－2可以在成釉細胞數量不能明顯增加的情況下，增強細胞存活力，延長功能細胞壽命，從而保證足夠的成釉細胞來完成分泌功能。而到釉質發育完成后，成釉細胞明顯變短，超微結構觀察發現成釉細胞間隙增大，細胞器減少，細胞核糖體脫顆粒，部分核膜不清，凋亡征象明顯，與Bcl－2的陰性表達相一致。此階段成釉細胞大量減少，最終與中間層、星網狀層以及外釉上皮結合形成縮余釉上皮。

研究提示:細胞凋亡是釉質發育形成過程中的一種有效機制，以之清除生命周期結束或功能消失的成釉細胞，Bcl－2對細胞凋亡的調控，一方面保證足夠的細胞完成分化后發揮分泌功能，又限定進入下一階段的細胞數目，從而維持組織本身細胞數目上內環境的穩定［4］。然而Bcl－2對細胞凋亡的調控機制目前尚未完全明了，細胞凋亡失調(凋亡不足或凋亡過度)是否可成為某些疾病的重要發病機制尚需進一步的深入研究［5］。

［1］Tsujimoto Y，Finger LR ，Yunis J，et al.Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18)chromosome translocation［J］.Science，1984，226(4678):1097－1099.

［2］Reed JC.Bcl－2－family proteins and hematologic malignancies:history and future prospects［J］.Blood，2008，111(7):3322 －3330.

［3］Bronckers AL ，Goei SW，Dumont E ，et al.In situ detection of apoptosis in dental and periodontal tissues of the adult mouse using annexin－V－biotin［J］.Histochem Cell Biol，2000，113(4):293－301.

［4］Smith CE.Cellular and chemical events during enamel maturation［J］.Crit Rev Oral Biol Med，1998，9(2):128 －161.

［5］Tanner EA，Blute TA，Brachmann CB，et al.Bcl－2 proteins and autophagy regulate mitochondrial dynamics during programmed cell death in the Drosophila ovary［J］.Development，2011，138(2):327－338.