聚酰胺樹脂提取血竭龍血素

樂 薇

（武漢長江工商學院工學院，湖北 武漢 430065）

聚酰胺樹脂提取血竭龍血素

樂 薇

（武漢長江工商學院工學院，湖北 武漢 430065）

研究了聚酰胺樹脂對血竭中龍血素A和龍血素B的提取效果。采用HPLC進行定量分析，考察了上樣方法、洗脫劑體積分數、洗脫流速、樹脂使用次數等因素對提取效果的影響，并確定了適宜的梯度洗脫方式。結果表明，將血竭樣品用乙酸乙酯溶解后，與聚酰胺樹脂混合，然后將溶劑蒸發完全進行吸附，樹脂的吸附量為1 g·（g樹脂）－1。在0.8 m L·min－1洗脫流速下，7 BV的50%乙醇可梯度洗脫被聚酰胺樹脂吸附的龍血素A和龍血素B，解吸率均達91%以上，聚酰胺樹脂使用3次后即需再生。該工藝收率高、操作簡便，適于血竭龍血素的提取。

聚酰胺樹脂；提取；血竭；龍血素

血竭是名貴中草藥，廣泛應用于膏、丸、丹、散、片及霧劑等中成藥產品中。隨著血竭資源的不斷開發及其成分分析、藥理作用、毒性試驗等方面研究的深入，血竭的臨床應用前景非常樂觀［1～3］。龍血素A和龍血素B是血竭中的重要指標成分，屬于黃酮類化合物［4，5］。聚酰胺是分離黃酮類化合物較常用的吸附劑［6，7］，黃酮分子中富含的酚羥基與聚酰胺分子中的酰胺基因雙方質子共享形成氫鍵而產生吸附，從而與不能形成氫鍵的組分分離，達到提純的目的。作者利用聚酰胺樹脂提取血竭中的龍血素，探討了相關因素對提取效果的影響，并確定了適宜的洗脫方式。

1 實驗

1.1 材料、試劑及儀器

血竭，云南云河藥業有限公司。龍血素A、龍血素B對照品，廣西中醫藥研究所。

乙酸乙酯，分析純，天津津東天正精細化工試劑廠；無水乙醇，分析純，上海振興化工一廠；乙腈，色譜純，上海陸都化學試劑廠。柱層析用聚酰胺（30～60目），上海第一化學試劑有限公司。

2537A型紫外分析儀，上海科藝光學儀器廠；L－7000型高效液相色譜儀，日本日立；Agilent C18（4.6 mm×150 mm）色譜柱，北京先明樂施科技發展有限公司；Lambda35型紫外可見分光光度計，PE公司；RE－52型旋轉蒸發器，上海安亭電子儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 吸附方法的選擇

參照文獻［8］對聚酰胺樹脂進行預處理。再向其中加入用乙酸乙酯溶解的血竭樣品原液，于80℃水浴中蒸發溶劑，并不時加以攪拌，直至溶劑蒸發完全。

分別考察不同血竭樣品與聚酰胺樹脂的質量比、吸附時間的吸附效果。

1.2.2 洗脫條件的選擇

在一定流速下，用乙醇對已吸附血竭樣品的聚酰胺樹脂進行解吸，計算龍血素A／B的解吸率及洗脫劑的用量。

1.2.3 龍血素A／B的 HPLC測定

（1）色譜條件

流動相為乙腈－1%冰醋酸（34∶66，體積比）；流速1.0 m L·min－1；檢測波長280 nm；靈敏度0.02 UFS；柱溫40℃。上述色譜條件下，龍血素A的保留時間為29 min，龍血素B的保留時間為32 min，二者分離度為1.7。

（2）標準曲線的繪制

將龍血素A對照品儲備溶液分別配制成濃度（μg·m L－1）為4.9、9.8、14.7、19.6、25.5、29.4的對照品溶液，經微孔濾膜過濾器（0.45μm）濾過，在上述色譜條件下進樣20μL，記錄色譜圖，進樣濃度（c）與峰面積（A）的回歸方程為：A＝612682.1c＋764068.5，相關系數R＝0.9996；線性范圍為6.3～127μg·m L－1。

將龍血素B對照品儲備溶液分別配制成濃度（μg·m L－1）為2.16、4.32、6.48、10.80、12.90的對照品溶液，經微孔濾膜過濾器（0.45μm）濾過，在上述色譜條件下進樣20μL，記錄色譜圖，進樣濃度（c）與峰面積（A）的回歸方程為：A＝542225.4c＋1760149；相關系數R＝0.9993；線性范圍為8.55～171μg·m L－1。

2 結果與討論

2.1 吸附方法的選擇

由于在聚酰胺樹脂上稀堿的洗脫能力強于乙醇，所以不能采用氫氧化鈉溶解血竭樣品上柱的方法。但改變上柱液的p H值至酸性范圍，血竭樣品原液幾乎不溶解，也不能被聚酰胺吸附，因此必須采用其它上柱方法。實驗發現，將血竭樣品用有機溶劑溶解后，與聚酰胺混合，然后將溶劑蒸發完全，可實現血竭樣品的吸附。

2.2 吸附條件的選擇

2.2.1 血竭樣品與聚酰胺樹脂的質量比

在一定量的聚酰胺樹脂中加入不同質量的血竭樣品原液（乙酸乙酯溶解），考察吸附效果，結果見表1。

表1 聚酰胺樹脂對血竭樣品的吸附效果Tab.1 Adsorption of dragon′s blood（dissolved in EtOAc）by polyamide resin

由表1可知，當血竭樣品與聚酰胺樹脂的質量比為1∶1時，聚酰胺即可達到吸附飽和，故選擇血竭樣品與聚酰胺的質量比為1∶1。

2.2.2 吸附時間

吸附時間亦即溶劑蒸發完全的時間。將3.5 g血竭樣品用3 m L乙酸乙酯溶解后，與3.5 g聚酰胺樹脂混合，置于80℃水浴中，每隔10 min觀察一次溶劑蒸發情況，發現30 min即可將溶劑蒸發完全。

2.3 洗脫條件的選擇

2.3.1 洗脫劑

洗脫劑的選用是影響吸附樹脂使用效果的重要環節，優選洗脫劑能提高產物的質量和吸附樹脂的使用效率。要求吸附質與洗脫劑的親和力大于吸附質和吸附劑的親和力，同時還要求洗脫劑有較低的沸點、易于蒸餾回收，實驗發現，乙醇作洗脫劑效果較好。

2.3.2 洗脫劑體積分數

用不同體積分數的乙醇對已吸附血竭樣品的聚酰胺樹脂進行解吸，結果見表2。

表2 乙醇體積分數對洗脫血竭龍血素的影響Tab.2 The effect of volume fraction of ethanol on desorption of loureirin in dragon′s blood

由表2可知，乙醇體積分數較低時（如30%），龍血素A、龍血素B不能解吸；50%乙醇作洗脫劑時，龍血素A、龍血素B解吸率均達到91%以上；繼續增大乙醇體積分數，龍血素A、龍血素B的解吸率反而下降。這可能是由于，乙醇體積分數較高時，其它的黃酮類化合物比龍血素A、龍血素B更易解吸，從而使龍血素A和龍血素B的解吸率下降。因此，選用50%的乙醇作洗脫劑。

2.3.3 洗脫流速

流速是柱層析分離的一個重要指標，流速過快會縮短分離時間，同時也使洗脫劑耗費更多；流速過慢雖然可以提高分離效果，但延長了分離時間。在不同流速下，用50%乙醇對已吸附飽和的聚酰胺樹脂進行解吸，當流出液中未檢測到龍血素時即認為洗脫完全，結果如圖1所示。

圖1 洗脫流速對聚酰胺樹脂洗脫情況的影響Fig.1 The effect of eluting velocity on the desorption for polyamide resin

由圖1可知，隨著洗脫流速的加快，洗脫液體積增大，洗脫時間縮短；洗脫流速為0.8 m L·min－1時所需洗脫液體積稍大于洗脫流速0.5 m L·min－1時的洗脫液體積，但前者比后者解吸時間短，所以選擇適宜的洗脫流速為0.8 m L·min－1。

2.3.4 梯度洗脫

聚酰胺樹脂對不同黃酮類化合物的親和作用有差異，對飽和吸附血竭的聚酰胺樹脂進行梯度洗脫，洗脫劑的體積分數分別為30%、50%、70%、90%。對各梯度洗脫部分所得干燥物進行HPLC分析，其色譜圖見圖2（a～c）（90%乙醇洗脫物在檢測條件下無色譜峰，未列出），圖2d是血竭全粉的HPLC色譜圖。

圖2 梯度洗脫物（a～c）和血竭全粉（d）的HPLC色譜Fig.2 The HPLC chromatograms of gradient eluate（a～c）and dragon′s blood powder（d）

進一步計算出各部分龍血素A和龍血素B的含 量，結果列于表3。

表3 聚酰胺樹脂的梯度洗脫結果Tab.3 The results of gradient elution for polyamide resin

由表3可知，50%的乙醇能將絕大部分的龍血素A和龍血素B洗脫下來，洗脫率均在91%以上。

2.4 樹脂重復使用次數的考察

在上述確定的吸附、洗脫條件下，考察聚酰胺樹脂使用次數對血竭中龍血素吸附和解吸的影響，結果見表4。

表4 聚酰胺樹脂使用次數對血竭龍血素吸附和解吸的影響Tab.4 The effect of frequency of use of polyamide resin on adsorption and desorption of loureirin in dragon′s blood

由表4可知，隨著吸附次數的增多，聚酰胺樹脂對血竭龍血素的吸附量呈下降趨勢，尤其是使用3次以上時更為明顯。這是因為，乙酸乙酯提取物中含有50%乙醇無法洗脫的難洗脫物，它們被吸附在聚酰胺樹脂表面，隨著吸附次數的增加，難洗脫物在樹脂上累積，降低了樹脂的有效吸附容量。同時，隨著吸附次數的增加，聚酰胺樹脂對血竭龍血素的解吸量也有所下降，其原因可能是樹脂上的難洗脫物對血竭龍血素也有一定的吸附作用。因此，重復使用3次后應對樹脂進行再生。

3 結論

將血竭樣品用乙酸乙酯溶解后，與聚酰胺樹脂混合，然后將溶劑蒸發完全進行吸附，血竭中龍血素的吸附量為1 g·（g樹脂）－1。在0.8 m L·min－1的洗脫流速下，7 BV的50%乙醇可梯度洗脫被聚酰胺樹脂吸附的龍血素A和龍血素B，解吸率均高于91%。該工藝收率高，操作簡便，適用于血竭龍血素的提取。

［1］ 付梅紅，方婧，王祝舉，等.血竭藥理研究與臨床應用概述［J］.時珍國醫國藥，2010，21（6）：200－202.

［2］ 劉芳，戴榮繼，鄧玉林，等.龍血竭化學成分研究進展［J］.中國藥房，2010，21（15）：99－101.

［3］ 樊蘭蘭，屠鵬飛，何鑒星，等.中藥龍血竭原植物劍葉龍血樹的形態組織學研究及所含樹脂的分布和成分檢測［J］.中國中藥雜志，2008，33（10）：1112－1117.

［4］ 高秀麗，蔣蒨，王鵬嬌，等.龍血竭高效液相色譜特征研究［J］.中國中藥雜志，2007，32（19）：2024－2025.

［5］ 胡迎慶，李靈芝，韓慧文.RP－HPLC測定龍血竭中龍血素A和B的含量［J］.藥物分析雜志，2003，23（1）：7－8.

［6］ 吳立軍.天然藥物化學［M］.北京：人民衛生出版社，2006：185.

［7］ 黃松，丁婕，陶艷，等.聚酰胺樹脂精制甜茶總黃酮的工藝研究［J］.中國新藥與臨床藥理，2010，21（3）：311－315.

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Abstraction of Loureirin A and B in Dragon′s Blood by Polyamide Resin

YUE Wei
（Engineering Institute of Wuhan Yangtze Business University，Wuhan430065，China）

The abstraction of loureirin A and B in dragon′s blood by polyamide resin was studied.The effect of sampling method，eluent volume fraction，eluting velocity，frequency of use of polyamide resin on the abstraction efficiency were investigated，and the quantitative analysis was conducted on HPLC.And the gradient elution way was optimized.Results showed that，the adsorbing capacity of polyamide was 1 g·g－1resin when the process was as follows：after dissolved with acetic ether，the sample was mixed with polyamide resin，and then the organic solvent was evaporated completely.The loureirin A and B adsorbed by polyamide resin could be gradiently eluted more than 91%by 7 BV of 50%ethanol at the eluting velocity of 0.8 m L·min－1.The process was fit for the abstraction of loureirin A and loureirin B in dragon′s blood with high yield and simple operation.

polyamide resin；abstraction；dragon′s blood；loureirin

TQ 460.6

A

1672－5425（2012）11－0057－04

10.3969／j.issn.1672－5425.2012.11.016

2012－07－16

樂薇（1979－），女，湖北沙市人，碩士，講師，研究方向：生物分析，E－mail：yuewei11＠126.com。