RP-HPLC測定茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量△

王光忠，邵貝貝，鄧媛媛，黃婕，劉焱文

(湖北中醫藥大學 中藥資源與中藥復方省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430061)

RP-HPLC測定茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量△

王光忠，邵貝貝，鄧媛媛，黃婕，劉焱文*

(湖北中醫藥大學 中藥資源與中藥復方省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430061)

目的建立茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量測定方法,為該提取物的質量控制提供依據。方法采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對茯苓乙醇提取物中茯苓酸進行定性定量分析，利用保留時間定性和外標兩點法定量。結果此方法線性關系良好，茯苓酸線性回歸方程為Y=565.41X+14.477(r=0.999 5)，平均回收率為99.76 %，RSD=1.13 %(n=6)。結論該方法簡便、可靠，可作為茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量測定方法。

茯苓乙醇提取物；茯苓酸；RP-HPLC；含量分析

茯苓為多孔菌科真菌Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,又名茯菟、茯靈、松薯、松苓等,首載于《神農本草經》,列為上品[1]。茯苓味甘、淡、性平，歸心、肺、脾、腎經。具有利水滲濕健脾，寧心的功能。用于水腫尿少，痰飲眩悸，脾虛食少，便溏泄瀉，心神不安，驚悸失眠等的治療[2]。茯苓中主要含有茯苓聚糖、三萜、脂肪酸等成分[3]。現代藥理學表明，茯苓三萜為該中藥的重要功效物質。茯苓乙醇提取物主要含總三萜類物質，而茯苓酸為其主要三萜成分[4-5],，具有抗炎[6]、抗腫瘤[7]及集落刺激因子誘生劑[8]等作用。本實驗采用高效液相色譜(RP-HPLC)分析方法，對茯苓乙醇提取物中的茯苓酸(pachymic acid)進行含量分析研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient 1100 series高效液相色譜儀(G1322A排氣閥，G1311A泵，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測器)，Aglient 色譜工作站，C18色譜柱；十萬分之一天平(Sartorius BP211D)；萬分之一天平(Metter Toledo AL204)。

1.2 試藥

茯苓乙醇提取物由本實驗室提供；茯苓酸對照品為本實驗室自制,經面積歸一化法測定后確認其純度大于98 %。乙腈為色譜純,水為重蒸餾水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Kromasil 100-5C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流速為1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-0.2 %醋酸(82∶18)；檢測波長：210 nm，色譜圖見圖1。

圖1 茯苓酸對照品及茯苓HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取減壓至恒重的茯苓酸對照品3 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得0.3 mg·mL-1的茯苓酸對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取茯苓乙醇提取物0.25 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，密塞，稱定，浸泡30 min，超聲30 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，過濾；得續濾液即為供試品。

2.4 線性關系的考察

分別精密吸取茯苓酸對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL,注入色譜儀中 ,測定其峰面積值。以對照品進樣量為橫坐標,峰面積積分值為縱坐標,繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程為：Y=565.41X+14.477，n=6。結果表明，茯苓酸在0.6～3.6 μg與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，重復進樣6次，記錄茯苓酸的峰面積，RSD=0.44 %(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一樣品溶液，分別于0，2，4，8，16 h各進樣10 μL，記錄茯苓酸的峰面積，RSD=1.30 %(n=6)，表明樣品溶液在16 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取茯苓乙醇提取物6份，按樣品含量測定項下的方法處理，并進行測定，結果表明茯苓酸的含量平均為2.72 %，RSD=1.38 %(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.8 回收率試驗

精密稱取已知含量茯苓乙醇提取物樣品6份，每份0.125 g，分別精密加入對照品3 mg，照供試品溶液的制備方法處理，測定茯苓酸的含量，平均回收率為99.76 %，RSD=1.13 %，表明該方法可靠性強，結果見表1。

表1 茯苓酸加樣回收試驗

2.9 樣品含量測定

分別取071820，071821，071822 3批茯苓乙醇提取物樣品，按供試品制備方法制備溶液，按上述色譜條件測定，計算樣品溶液中茯苓酸的含量分別為2.67 %，1.60 %，2.77 %。

3 討論

茯苓三萜類成分具有抗腫瘤、抗炎、調節免疫功能等多種生物活性。茯苓藥材的乙醇提取物主要含三萜類成分，總三萜含量達40 %。本論文采用RP-HPLC分析方法，對茯苓乙醇提取物中的主要三萜類成分茯苓酸進行了分析研究，其研究結果可望為茯苓三萜有效物質部位的開發利用提供依據。

實驗考察了甲醇、乙腈、三氯甲烷3種溶媒的提取效果，以甲醇提取制得樣品的測定值較高，因此選擇甲醇作為提取溶媒。考察了兩種溶劑不同比例的洗脫效果，最終選擇乙腈-0.2 %醋酸(82∶18)作為流動相。

由方法學研究結果和3批樣品的測定結果看，本方法線性關系良好，精密度試驗、穩定性試驗、重現性試驗和回收率試驗均符合要求，表明該方法準確可靠，可用于茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量測定。

[1] 肖培根 新編中藥志[M].III.北京:化學工業出版社,2002：8901.

[2] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：224.

[3] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草精選本[M].上冊.上海:上海科學技術出版社,1999:554-554,1871.

[4] 張秀明.茯苓藥理作用研究概況[J].中藥材,2001,24(6):447-449.

[5] 楊樹東,包海鷹.茯苓中三萜類和多糖類成分的研究進展[J].菌物研究,2005,3(3):55-61.

[6] GINER E M,MANEZ S,RECIO M C,et al.In vivo studieson the anti2inflammatory activity of pachymic and dehydrotumulosic acids[J].Planta Med,2000,66(3):221-227.

[7] GAPTER L,WANG Z,GLINSKI J,et al.Induction of apoptosis in prostate cancer cells by pachymic acid f rom Poria cocos[J].Biochem B iophys Res Commun,2005,332(4):1153-1161.

[8] 李靜,黎紅,許津.茯苓中集落刺激因子誘生劑的分離鑒定[J].中國藥學雜志,1997,32(7)：401-403.

DeterminationofPachymicAcidinEthanolExtractofPoriacocosbyRP-HPLC

WANG Guang-zhong,SHAO Bei-bei,DENG Yuan-yuan,HUANG Jie,LIU Yan-wen

(KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResourceandCompoundPrescription,HubeiUniversityofTCM,Wuhan430061,China)

Objective: To determine the content of pachymic acid in ethanol extract ofPoriacocosand provide the basis for the effective quality control of the material.MethodsPachymic acid in ethanol extract ofPoriacocosis derterminated by RP-HPLC with the retention time qualitative and external standard method quantitative.ResultsThe linear regression equation isY=565.41X+14.477(r=0.999 5),the average recovery is 99.76 %,RSD=1.13 %(n=6).ConclusionThe method is simple and reliable and can be used as a a quality control for ethanol extract ofPoriacocos.

Ethanol extract ofPoriacocos;Pachymic acid;RP-HPLC;Content analysis

國家自然科學基金項目(30970295)

*劉焱文，Tel：(027)88920834，E-mail：ywliu2008@163.com

2011-08-10)