HPLC雙波長融合法測定忍冬藤藥材中三種有效成分的含量

姚 宣，包永睿，孟憲生，王 帥

（遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝，性甘、寒，歸肺、胃經。收載于2010版中國藥典一部，具有清熱解毒、疏風通絡功能。現代化學、藥理研究表明：忍冬藤中的主要活性成分為有機酸類和環烯醚萜苷類，綠原酸和咖啡酸具有一定的抗菌抗感染作用，在忍冬藤中含量較高，為其主要活性成分，馬錢苷有抗炎作用及調節免疫功能作用，三者共同發揮藥效清熱解毒、疏風通絡，測定這三個成分的含量能夠更好地整體評價藥材的內在質量。

本文以高效液相色譜法結合多波長融合技術，根據三種成分不同的光譜特性，建立了在兩個紫外檢測波長下同時測定綠原酸、咖啡酸、馬錢苷三個成分含量的方法，該方法通過一針多測，節省了時間，節約了溶劑，克服了單波長檢測時信息量有限的缺點，以一張圖譜全面、真實地揭示中藥材的內在質量特征。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100Series高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器，自動進樣，ChemStation工作站（Agilent科技有限公司）；Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5m）；CP225D 電子分析天平（德國Sartorius，十萬分之一）；HS6150型超聲波清洗器（天津恒奧科技發展有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸（中國藥品生物制品檢定所，批號110753－200413），咖啡酸 （中國藥品生物制品檢定所，批號110885－200102），馬錢苷 （中國藥品生物制品檢定所，批號111640－200503）；忍冬藤（購自大連保健大藥房）經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝，乙腈、甲醇、甲酸，實驗用水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5m）；流動相：A-3%甲酸水，B-乙腈（梯度洗脫程序：0～30min，9%B；31～35min，15%B；36～60min，18%B；61～70min，23%B）；流速：1.0mL／min；柱溫：25℃；檢測波長：236、327nm；進樣量10μL。

2.2 對照品溶液的制備

綠原酸對照品溶液：精密稱取綠原酸對照品適量，加50%甲醇制成0.391mg／mL對照品溶液，備用。咖啡酸對照品溶液：精密稱取咖啡酸對照品適量，加50%甲醇制成0.147mg／mL對照品溶液，備用。馬錢苷對照品溶液：精密稱取馬錢苷對照品適量，加50%甲醇制成0.217mg／mL對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取忍冬藤粉碎（過3號篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱定重量，超聲處理（250W，30kHz）30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線與線性關系

取濃度為0.103mg／mL，0.049mg／mL，0.144mg／mL的綠原酸、咖啡酸、馬錢苷對照品，精密吸取上述對照品溶液4、7、10、13、16、19μL，注入液相色譜儀，測得峰面積積分值。以對照品的含量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。結果表明，綠原酸的回歸方程是Y＝21.751X－33.913（r＝0.9999，n＝6），在0.5212～2.4757μg／mL范圍內線性關系良好；咖啡酸的回歸方程是Y＝59.891X－27.598（r＝0.9999，n＝6），咖啡酸在0.1960～0.9310μg／mL范圍內線性關系良好。馬錢苷的回歸方程是Y＝15.549X－8.5666（r＝0.9999，n＝6），馬錢苷在0.5760～2.7360μg／mL濃度范圍內線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗

分別精密吸取“2.2”項下配制的綠原酸、咖啡酸、馬錢苷對照品10μL，連續進樣6次，記錄236、327nm波長下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜，結果融合后圖譜中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷各峰相對峰面積RSD分別為1.07%、0.95%、1.53%，均小于3.00%，表明檢測系統的進樣精密度良好。

2.4.3 重復性試驗

按“2.3”供試品溶液的制備方法，取同一藥材粉末，平行制備供試品溶液6份，按上述色譜條件進樣10μL，記錄236、327nm波長下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜，結果以融合后圖譜中各峰相對峰面積計算綠原酸、咖啡酸、馬錢苷峰含量，RSD 分別為 1.31%、1.26%、1.07%，RSD均小于3.00%，表明方法的重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗

精密吸取同一份供試品溶液，分別在制備好樣品供試液后的0、2、4、6、8、10h進樣分析，按上述色譜條件進樣分析，記錄236、327nm波長下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜，結果融合后圖譜中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷各峰相對峰面積 RSD分別為1.34%、1.63%、1.16%，RSD均小于3.00%，表明樣品在10h內穩定。

2.4.5 回收率試驗

精密稱取已知含量的忍冬藤藥材粉末約0.5g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，各精密加入適量綠原酸、咖啡酸、馬錢苷對照品，再精密加入50%甲醇至25mL，超聲處理30min，取出，放冷，按上述方法和條件提取測定。記錄236、327nm波長下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜，以融合后圖譜中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷峰面積計算含量，計算加樣回收率，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷平均加樣回收率分別為99.60%、99.73%、99.48%，RSD小于4.00%。

2.5 樣品測定

按“2.3”項下所述制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣，采用多波長融合技術，使用Matlab7.1編程對不同波長的色譜圖進行融合，記錄236、327nm波長下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜。見圖1、圖2、圖3。

3 討論

中藥化學成分復雜，常常通過多個成分共同發揮藥效，單一成分定量難以完整地反映忍冬藤藥材的化學組分特征，本文將現代分析檢測手段結合多波長融合技術，對不同波長的中藥材指標成分的譜圖信息進行融合，互補不同類成分特征吸收的差異性，克服單一波長單一指標檢測時信息量不足難以完整地反映藥材質量的缺點，同時測定其中多項指標成分含量，獲得每個成分的最大信噪比，增加了含量測定的準確度，在此中藥的多個指標性成分基礎上建立忍冬藤指紋圖譜，科學合理、綜合地評價藥物質量，實現中藥質量可控，保證療效。

忍冬藤藥材中主要含有有機酸類成分、環烯醚萜類成分，在327nm波長下，有機酸類成分綠原酸和咖啡酸有最大吸收，且環烯醚萜類成分馬錢苷無吸收，236nm波長下，環烯醚萜類成分馬錢苷有最大吸收，有機酸類成分綠原酸和咖啡酸吸收較小，經多波長融合，記錄236nm、327nm波長下的色譜圖，按照最大峰面積覆蓋融合圖譜，使用 Matlab 7.1將兩個波長的結果融合，經多波長融合后，藥材的多個指標性成分同時在一張圖譜中具有最大吸收，從而同時測定藥材中有效成分的含量，全面控制藥材的質量。

圖1 忍冬藤236nm波長下HPLC色譜

圖2 忍冬藤327nm波長下HPLC色譜

圖3 忍冬藤全時段多波長融合色譜

流動相選擇上考察了甲醇和乙腈兩種流動相，乙腈紫外吸收小，產生的噪聲小，適合在進行紫外短波長上的高靈敏度分析，乙腈作為流動相壓力較小，對色譜柱的損害小，洗脫能力強，用乙腈會比甲醇出峰早，因此乙腈比甲醇更適合于藥材的分離。

本文結果表明，應用多波長融合HPLC法同時測定綠原酸、咖啡酸、馬錢苷結果準確，重現性好，可有效控制該藥的質量，并且方法簡單，可以全面整體地評價忍冬藤的質量。

[1]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典（一部）[S].北京：化學工業出版社，2010：179.

[2]錢正明，李會軍，李萍，等.高效液相色譜法測定忍冬藤和葉中8種活性成分[J].分析化學，2007，35（8）：1159-1163.

[3]李江.高效液相色譜法測定忍冬藤不同采收期中綠原酸和咖啡酸的含量[J].藥品鑒定，2010，7（32）：51-52.

[4]陳軍，馬雙.HPLC法測定忍冬藤中當藥苷和馬錢苷的含量[J].藥物分析雜志，2005，25（12）：1451-1452.

[5]茍占平，萬德光.HPLC測定6種忍冬藤中綠原酸的含量[J].中成藥，2006，28（3）：55-57.

[6]聶磊，胡震，羅國安，等.中藥指紋圖譜的融合技術[J].分析化學，2005，33（6）：898.

[7]范驍輝，葉正良，程翼宇，等.基于信息融合的中藥多元色譜指紋圖譜相似性計算方法[J].高等學校化學學報，2006，27（1）：26-29.

[8]趙洪芝，孟憲生，葉挺祥，等.雙波融合HPLC測定六味地黃丸中馬錢苷、丹皮酚的含量[J].中國中藥雜志，2008（19）：2182-2184.

[9]高輝，林曉，徐麗華.HPLC法測定忍冬藤飲片中綠原酸的含量[J].齊魯藥事，2011，30（2）：94-95.