伏毛鐵棒錘藥材HPLC指紋圖譜研究

馬學琴，康小蘭，王 飛，付雪艷，何志梅

（寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004）

鐵棒錘是毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘Aconitum szechenyianumGay.和伏毛鐵棒錘Aconitum Flavum Hand.Mazz.的干燥塊根[1]。2010年版中國藥典未收載品種，為陜、甘、寧等省應用較廣的一種民間草藥[2]。其味苦辛，性熱，有大毒，具“活血祛瘀，祛風濕，止痛”等作用[3]。目前，課題組對其所含的總生物堿以及烏頭堿的含量已有研究[4－5]。本研究繼續從綜合評價伏毛鐵棒錘質量的角度出發，建立其HPLC指紋圖譜，為伏毛鐵棒錘藥材的鑒定提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日立LC-2000高效液相色譜儀；島津UV-2550紫外分光光度計；奧豪斯AP210型分析天平。

1.2 藥品與試劑

烏頭堿對照品（批號110720-200409）；甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA）；娃哈哈純凈水；其它試劑均為分析純。鐵棒錘為自采，來源：固原六盤山（樣品編號S1－S3）、月亮山（樣品編號S4－S5）、種植園（樣品編號S6－S8）、黑城鄉（樣品編號S9－S10）；經寧夏醫科大學藥學院生藥學教研室鑒定為毛茛科烏頭屬植物伏毛鐵棒錘AconitumFlavum Hand.Mazz.的干燥塊根。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：美國 Thermo ODS-2HYPERSIL（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：A-甲醇－乙腈（3∶2），B-醋酸－醋酸鈉（pH＝4.5）緩沖液梯度洗脫：0～10min 1%～5%A，10～30min 5%～15%A，30～40min 15%～25%A，40～50min 25%～80%A，50～60min 80%～100%A，60～70min 100%A；檢測波長：240～280nm，流速0.8mL／min，柱溫：30℃。

2.2 對照品溶液制備

精密稱量烏頭堿對照品5.6mg，置5mL容量瓶中，色譜甲醇溶解，定容，得烏頭堿對照品貯備液。

2.3 供試品溶液制備

取伏毛鐵棒錘藥材，粉碎，過80目篩，60℃干燥至恒重。精密稱取適量（相當生藥1g），置200mL具塞三角錐形瓶中，加入氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）20mL，超聲提取40min，冷卻，過濾，濾液水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至10mL得供試品溶液，臨用前0.45μm微孔濾膜過濾。

2.4 伏毛鐵棒錘藥材指紋圖譜方法學考察

（1）精密度試驗：按“2.3”項下方法制備供試品溶液，取同一供試液，連續進樣6次，按“2.1”色譜條件測定，選擇25個共有峰進行比較。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD＜0.23%，各共有峰的相對峰面積RSD＜2.14，表明供試品的精密度良好。

（2）重復性試驗：取同一批次伏毛鐵棒錘藥材，按“2.3”項下方法平行操作，制備6份供試液，按“2.1”色譜條件測定。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD＜1.15%，各共有峰的相對峰面積RSD＜2.78，表明方法的重現性良好。

（3）穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進樣測定，對25個共有峰進行比較，結果各共有峰的相對保留時間RSD＜0.21%，各共有峰的相對峰面積RSD＜1.66%，表明供試品溶液在24內穩定。

3 結果

3.1 指紋圖譜的采集及共有峰的標定

按照“2.3”項下方法，制備10批次伏毛鐵棒錘供試液，按“2.1”色譜條件測定并記錄色譜圖。采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版》軟件自動匹配10批次伏毛鐵棒錘藥材HPLC色譜圖相關參數，以平均數法作為對照指紋圖譜的生成方法，設時間窗寬度為0.2min，提取伏毛鐵棒錘藥材的共有模式建立對照指紋圖譜，見圖1。

圖1 伏毛鐵棒錘藥材對照指紋圖譜

標定共有峰共25個，以峰面積較大的5號峰為參照物峰，分別計算其余共有峰與5號參照物峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，10批次伏毛鐵棒錘藥材共有峰的相對保留時間RSD小于0.5%，而相對峰面積RSD在11.34～27.61之間，說明各批次藥材之間共有峰的保留時間有著很好的一致性，但由于來源的不同，其峰面積相差較大。

3.2 相似度計算

將10批伏毛鐵棒錘藥材樣品指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版》軟件，計算各樣品指紋圖譜與生成的對照圖譜的相似度，樣品S1～S10的相似度依次為0.927、0.901、0.953、0.918、0.911、0.926、0.916、0.933、0.937、0.903。結果表明，10批次藥材與對照指紋圖譜的相似度結果均大于0.9，相關性良好。

4 討論

4.1 伏毛鐵棒錘藥材相似度評價

本實驗所采集藥材均來自寧夏中部干旱帶固原地區，海拔高度在2600m左右，是伏毛鐵棒錘聚集生長的地區。由于此地區土壤、水分、氣候、陽光、溫度等條件較為相似，并且所采集的伏毛鐵棒錘均為兩年生，故藥材之間一致性較好，相似度均在0.9以上。

4.2 指紋圖譜參照物峰的選擇

本實驗最初以烏頭堿色譜峰作為參照物峰，但其峰面積相對較小（峰面積＜總峰面積的5%），根據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》中的規定，峰面積相對較小的色譜峰誤差較大，不適宜作為參照物峰。故本實驗選擇峰面積相對較大的5號色譜峰作為參照物峰，其余共有峰與其的比值誤差較小，結果較為準確。

4.3 波長的選擇

本實驗采用DAD檢測器，在進行供試品溶液全波長掃描時，供試液的最大吸光度在260nm，故選用240～280nm整合波長的色譜圖，能夠捕捉到更多的色譜峰。

4.4 供試品制備方法的優化

本實驗選用70%乙醇、100%甲醇、氯仿－甲醇（2∶1）、氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）等溶劑，回流、超聲等提取方法，并進行了提取工藝的正交試驗，以峰之間的分離度和峰的個數為指標，優選出氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）為溶劑，超聲提取時，供試液色譜峰的個數最多且分離度較好，故選用此法。

本研究建立了伏毛鐵棒錘HPLC指紋圖譜，從藥材整體色譜圖入手，選取了25個特征峰構成了伏毛鐵棒錘的指紋圖譜，能提供更全面的質量控制信息，為鑒別該藥材提供了更多的參考數據。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：化學工業出版社，1985.

[2]張銀霞，張銀娟，唐建寧，等.六盤山區伏毛鐵棒錘資源調查的研究與評價[J].農業科學研究，2008，29（1）：55-57.

[3]王毓杰，張 靜，田會萍，等.民族藥鐵棒錘炮制減毒原理初步研究[J].中國中藥雜志，2010，35（5）：588-592.

[4]付雪艷，董 琳，權洪峰，等.鐵棒錘總生物堿的含量測定[J].科協論壇，2007（8）：476.

[5]付雪艷，董 琳，張義偉，等.HPLC測定鐵棒錘中烏頭堿的含量[J].科協論壇，2007（8）：456.