基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定畜禽肉中殘留的13種鎮(zhèn)靜藥物

渠 巖，路 勇，馮 楠，趙俊平，金偉偉，王貴雙

(1.北京市食品釀造研究所，北京 100050；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京 100041)

基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定畜禽肉中殘留的13種鎮(zhèn)靜藥物

渠 巖1，路 勇2，馮 楠2，趙俊平2，金偉偉1，王貴雙1

(1.北京市食品釀造研究所，北京 100050；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京 100041)

建立同時測定畜禽肉中13種鎮(zhèn)靜藥物(阿普唑侖、咪達(dá)唑侖、三唑侖、艾司唑侖、奧沙西泮、地西泮、硝西泮、氯硝西泮、卡馬西平、利多卡因、苯巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥)殘留量的基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。樣品經(jīng)基質(zhì)固相分散樣品制備試劑盒凈化后，進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，外標(biāo)法定量。采用BEH C18液相色譜柱分離，以10mmol/L乙酸銨溶液-甲醇為流動相進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明：13種鎮(zhèn)靜藥物的方法檢出限為0.05～3μg/kg，線性范圍內(nèi)低、中、高3個添加水平的回收率為77.4%～100.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～14.8%。該方法具有簡便快捷、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等特點，適用于對上述鎮(zhèn)靜藥物在畜禽肉中殘留的檢測。

鎮(zhèn)靜藥；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；基質(zhì)固相分散；畜禽肉

鎮(zhèn)靜藥物(sedative)是一類具有抑制神經(jīng)興奮、減少機(jī)體活動量、安眠鎮(zhèn)靜作用的一類藥物，多用于臨床。常見的有苯二氮卓類、巴比妥類以及吩噻嗪類。我國農(nóng)業(yè)部176號和235號公告規(guī)定，嚴(yán)禁在動物飼料和飲用水中使用此類藥物，在動物源食品中不得檢出此類藥物。但是，一些畜牧業(yè)飼養(yǎng)者為了在畜禽飼養(yǎng)過程中達(dá)到鎮(zhèn)靜催眠、增重催肥的目的，或者在動物運輸過程中為減少動物死亡和體重下降，防止肉品質(zhì)降低，會擅自使用此類藥物以謀取更多的經(jīng)濟(jì)利益。而此類藥物的長期添加會不可避免地導(dǎo)致動物源食品中的殘留，這將對消費者人身健康造成不良影響。

目前，鎮(zhèn)靜藥物的檢測方法主要集中在液相色譜法(liquid chromatography，LC)[1-2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)[3-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[7-10]等。其樣品前處理技術(shù)也得到了快速發(fā)展，主要有液-液萃取[11-12]、固相萃取[10,13]、固相微萃取[14]等。

本研究采用基質(zhì)固相分散(matrix solid phase dispersion，MSPD)技術(shù)進(jìn)行樣品前處理，相比較液-液萃取、固相萃取和固相微萃取方法，具有操作簡捷，試劑消耗少的優(yōu)勢[15-16]，采用基質(zhì)固相分散樣品制備試劑盒，保證提取結(jié)果穩(wěn)定、提取效率高；采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS)既能保證對禁用藥物的檢測靈敏度，又能兼顧分析速度快、分離度高，可為目標(biāo)物質(zhì)的定性、定量分析提供可靠依據(jù)，適用于遇到重大食品安全突發(fā)事件，保證在短時間內(nèi)畜禽肉中鎮(zhèn)靜藥物的高通量快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

畜禽肉為從超市和市場采購的生鮮肉，涉及的畜禽種類包括豬、牛、羊、雞、鴨等。

阿普唑侖(alprazolam)、咪達(dá)唑侖(midazolam)、三唑侖(triazolam)、艾司唑侖(estazolam)、奧沙西泮(oxazeoam)、地西泮(diazepam)、硝西泮(nitrazepam)、氯硝西泮(clonazepam)、卡馬西平(carbamazepin)、利多卡因(lidocaine)、苯巴比妥(phenobarbita)、異戊巴比妥(amobarbital)、司可巴比妥(secobarbita)(純度≥95%；1000mg/kg標(biāo)準(zhǔn)儲備液：13種藥物分別用甲醇溶解，0～4℃避光保存) 中國食品藥品檢定研究院；乙酸銨 德國CNW Technologies GmbH公司；甲醇、乙腈(色譜純)美國Fisher公司；乙酸(分析純) 北京化學(xué)試劑公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity＠UPLC-Xevo TQ-S型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、DisQue基質(zhì)固相分散樣品制備試劑盒美國Waters公司；高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理方法

稱取切碎的禽畜肉樣品15.0g于50mL DisQuE提取管中，加入15mL體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸乙腈溶液。渦旋振蕩5min至充分混勻，4000r/min離心5min。吸取7.5mL上述乙腈提取液至15mL DisQuE 清除管(含有150mg C18)中，渦旋振蕩30s，10000r/min離心5min。吸取100μL最終提取液至進(jìn)樣瓶，加入900μL體積分?jǐn)?shù)10%甲醇溶液稀釋混勻，待進(jìn)樣分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters Aqutity＠BEH C18柱(2.1mm× 50mm，1.7μm)；流速：0.4mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL；流動相：甲醇-10mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution program

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：ESI+；監(jiān)測方式：多反應(yīng)檢測；毛細(xì)管電壓：3.0kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：400℃；錐孔氣流量(氮氣)：150L/h；脫溶劑氣流量(氮氣)：900L/h；碰撞氣流速(氬氣)：0.17mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理與凈化條件的優(yōu)化

對比MSPD試劑盒方法與液-液萃取方法、固相萃取法的提取凈化效果。13種目標(biāo)物經(jīng)液-液萃取[11]后的回收率為61.8%～108.4%，前處理用時約3 h。采用固相萃取方法[13]，目標(biāo)物的回收率為47.3%～95.2%，前處理用時約2.5h。而經(jīng)過MSPD方法處理后，目標(biāo)物的回收率為70.3%～97.4%，用時約15min。結(jié)果說明，3種前處理方法均能夠滿足檢測需求，但MSPD試劑盒方法由于集樣品勻化、提取、凈化等過程于一體，樣品處理簡便快捷，節(jié)省大量樣品處理時間，因此選為本研究的樣品處理方法。

考察不同提取劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇對巴比妥類藥物的回收率影響很大。加標(biāo)回收實驗結(jié)果顯示，用甲醇提取苯巴比妥、異戊巴比妥和司可巴比妥的回收率為41.3%～48.9%。用乙腈提取所有目標(biāo)物的回收率基本可以滿足分析要求，回收率為77.4%～100.2%，且干擾較少，因此選擇乙腈作為提取劑。

2.2 分析方法評價

2.2.1 多反應(yīng)檢測條件選擇

表2 13種鎮(zhèn)靜藥物的定性和定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量Table 2 Quantitative ions, cone voltages and collision energies of thirteen sedatives

圖1 空白豬肉中添加13種鎮(zhèn)靜藥物的多反應(yīng)檢測色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of blank pork spiked separately with thirteen sedatives

本研究使用UPLC-MS/MS方法，通過多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)方式進(jìn)行采集，選擇目標(biāo)物質(zhì)的兩對“母離子/子離子”，其中響應(yīng)較強(qiáng)的離子對作為定量離子對，另一對作為定性離子對。13種鎮(zhèn)靜藥物的定量和定性離子對、錐孔電壓、碰撞能量以及保留時間等參數(shù)見表2，MRM色譜圖見圖1。

2.2.2 線性范圍、檢出限和定量限

表3 13種鎮(zhèn)靜藥物的回歸方程、檢出限和定量限Table 3 Regression equations, limits of detections and limits of quantification of thirteen sedatives

取含有阿普唑侖、咪達(dá)唑侖、利多卡因各0.01、0.05、0.10、0.50、1.00μg/kg，卡馬西平、艾司唑侖、氯硝西泮、硝西泮、三唑侖、地西泮各0.1、 0.5、1.0、5.0、10.0μg/kg，奧沙西泮1、5、10、50、100μg/kg，苯巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥各10、50、100、500、1000μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)樣。根據(jù)各藥物質(zhì)量濃度和定量離子色譜峰面積進(jìn)行線性回歸，根據(jù)各定量離子3和10倍信噪比(RSN)對應(yīng)樣品中的濃度水平得到檢出限和定量限，結(jié)果見表3。

2.2.3 方法的回收率和精密度

以空白豬肉為樣品，進(jìn)行3個標(biāo)準(zhǔn)品添加水平的回收實驗，每個添加水平重復(fù)測定3次，分別計算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表4。

表4 豬肉樣品中13種鎮(zhèn)靜藥物添加回收實驗結(jié)果Table 4 Average recoveries and RSDs of thirteen sedatives

13種鎮(zhèn)靜藥物在空白豬肉中的平均添加回收率為77.4%～100.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～14.8%。表明該鎮(zhèn)靜藥物殘留的檢測方法可靠，重現(xiàn)性好，精密度和準(zhǔn)確度均能達(dá)到檢測要求。

3 結(jié) 論

本實驗通過對樣品前處理方法、提取劑和LC-MS-MS條件優(yōu)化，建立了一套可以同時檢測畜禽肉中13種鎮(zhèn)靜藥物的篩查方法。該方法利用基質(zhì)固相分散樣品制備試劑盒，采用乙腈提取，得到了較好的提取效果。同時利用定性定量離子對進(jìn)行確證，通過MRM進(jìn)行信號采集，空白樣品加標(biāo)回收實驗得到了較高且穩(wěn)定的回收率。該方法與現(xiàn)有文獻(xiàn)相比，操作過程簡單、分析時間快(單個樣品的處理分析時間不超過30min)、靈敏度高(檢出限為0.05～3μg/kg)。該方法結(jié)果準(zhǔn)確，可以滿足篩查和定量的要求，為其他動物源食品中鎮(zhèn)靜藥物的檢測提供參考。

[1] 王海嬌, 周艷明, 牛森. 高效液相色譜法測定豬肉中安定殘留量[J].中國食品衛(wèi)生雜志, 2006, 18(2): 117-118.

[2] 范盛先, 黃玲利, 袁宗輝, 等. 豬腎臟中氯丙嗪和異丙嗪殘留檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2005, 25(4): 412-413.

[3] KINANI S, BOUCHONNET S, MILAN N, et al. A sensitive and selective method for the detection of diazepam and its main metabolites in urine by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Chromatography A, 2007, 1141(1): 131-137.

[4] 趙海香, 邱月明, 汪麗萍, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜同時測定豬肉中3種巴比妥藥物殘留[J]. 分析化學(xué), 2005, 33(6): 777-780.

[5] 李軍, 魏春敏, 袁桂艷, 等. 人血漿6種中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物氣相色譜-質(zhì)譜法測定及臨床應(yīng)用[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2009, 44(22): 1745-1748.

[6] 曹潔, 王玉瑾, 贠克明, 等. 氯硝西泮的氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法快速檢測[J]. 中國藥物與臨床, 2007, 7(7): 542-543.

[7] KIRCHHERR H, KU..HN-VELTEN W N. Quantitative determination of forty-eight antidepressants and antipsychotics in human serum by HPLC tandem mass spectrometry: A multi-level, single-sample approach[J]. J Chromatography B, 2006, 843(1): 100-113.

[8] DELAHAUT P, LEVAUX C, ELOY P, et al. Validation of a method for detecting and quantifying tranquillisers and a β-blocker in pig tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2003, 483: 335-340.

[9] KAUFMANN A, RYSER B. Multiresidue analysis of tranquilizers and the beta-blocker Carazolol in meat by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2001, 15(18): 1747-1751.

[10] 郭德華, 鄧曉軍, 趙善貞, 等. 固相萃取-高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測動物源性食品中76種獸藥殘留[J]. 分析化學(xué), 2010, 38(3): 318-324.

[11] 孫雷, 張驪, 徐倩, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬肉和豬腎中殘留的10種鎮(zhèn)靜劑類藥物[J]. 色譜, 2010, 28(1): 38-42.

[12] 金永春, 蔡明招, 黃曉蘭, 等. 人血中10種常見毒品的GC-MS同時檢測方法研究[J]. 分析測試學(xué)報, 2007, 26(2): 151-155.

[13] 陳建虎. 固相萃取/離子阱氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用對血液中多種安眠藥物的同時測定[J]. 分析測試學(xué)報, 2010, 29(1): 84-87.

[14] Van HOUT M W J, Van EGMOND W M A, FRANKE J P, et al. Feasibility of the direct coupling of solid-phase extraction-pipette tips with a programmed-temperature vaporiser for gas chromatographic analysis of drugs in plasma[J]. J Chromatography A, 2002, 766(1): 37-45.

[15] LEANDRO C C, HANCOCK P, FUSSELL R J, et al. Ultra-performance liquid chromatography for the determination of pesticide residues in foods by tandem quadrupole mass spectrometry with polarity switching [J]. J Chromatography A, 2007, 1144(2): 161-169.

[16] 王煉, 黎源倩, 王海波. 基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定畜禽肉和牛奶中20種獸藥殘留[J]. 分析化學(xué), 2011, 39 (2): 203-207.

Determination of Thirteen Sedative Residues in Meat by Matrix Solid Phase Dispersion-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

QU Yan1，LU Yong2，F(xiàn)ENG Nan2，ZHAO Jun-ping2，JIN Wei-wei1，WANG Gui-shuang1

(1. Beijing Food Brewing Institute, Beijing 100050, China；
2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring, Beijing 100041, China)

A matrix solid phase dispersion (MSPD) and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method has been developed for the simultaneous determination of alprazolam, midazolam, triazolam, estazolam, oxazeoam, diazepam, nitrazepam, clonazepam, carbamazepin, lidocaine, phenobarbita, amobarbital and secobarbita residues in meat. Sample extract was cleaned up using an MSPD kit before UPLC-MS/MS. The analytes were monitored under multireaction monitoring (MRM) mode and quantified by an external standard method. The chromatographic separation was achieved on a BEH C18 column using a mobile phase composed of 10 mmol/L ammonium acetate and methanol through gradient elution. The results showed that the limits of detection for 13 sedatives ranged between 0.05 and 3 μg/kg. The average spike recoveries for the sedatives in a blank pork sample at three spike levels were 77.4%－100.2% with relative standard deviation (RSD) of 1.3%－14.8% (n ＝3). The method was simple, rapid, sensitive, accurate and applicable for the determination of 13 sedative residues in meat.

sedative drug；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；matrix solid phase dispersion (MSPD)；meat

TS207.3；O657

A

1002-6630(2012)08-0252-04

2011-12-21

北京市科委計劃項目(D101110047710004)

渠巖(1984—)，男，碩士，研究方向為食品分析。E-mail：quyan_0220@163.com