膠體金免疫層析法和氣相色譜法測定動物產品中氯霉素殘留

宋紅波，陳 軍，王 棟，方 琳，余文婕，儲 芳

(江蘇省產品質量監督檢驗研究院溧陽檢測中心，溧陽市農畜水產品質量監督檢驗測試中心，江蘇 溧陽 213300)

膠體金免疫層析法和氣相色譜法測定動物產品中氯霉素殘留

宋紅波，陳 軍，王 棟，方 琳，余文婕，儲 芳

(江蘇省產品質量監督檢驗研究院溧陽檢測中心，溧陽市農畜水產品質量監督檢驗測試中心，江蘇 溧陽 213300)

對動物產品中氯霉素殘留檢測的膠體金免疫層析法和氣相色譜法進行比較研究。向樣品中分別添加0.3、0.5、1.5μg/kg三個添加水平的氯霉素標準品，用兩種方法進行檢測。膠體金免疫層析法對0.5μg/kg以上均能檢出，氣相色譜法平均回收率分別為78.1%、85.3%和88.3%，變異系數為5.3%～9.0%，最低檢測限為0.3μg/kg。對108個樣品用膠體金免疫層析法篩選出3個陽性樣品，經氣相色譜法驗證皆為陽性，105個陰性樣品經氣相色譜法檢測皆為陰性，未發現假陽性和假陰性。結果表明：膠體金免疫層析法具有快速，簡便，特異，靈敏度高的特點，適合基層檢驗機構對動物產品中氯霉素殘留現場快速篩選；氣相色譜法靈敏度高，適用于陽性樣品的精確定量。

動物產品；氯霉素；膠體金免疫層析法；氣相色譜法

氯霉素是一類廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有很好的抑制作用，由于其優良的抗菌性、穩定的藥性和低廉的價格，曾作為細菌性疾病的治療藥物廣泛應用于人和動物臨床[1]。然而研究發現氯霉素對人體的造血系統毒害極大，同時具有肝臟毒性[2]。許多國家已禁止氯霉素在動物生產中使用，聯合國糧農組織也建議在畜牧業生產中停止使用氯霉素[3]，歐盟規定進口水產品中氯霉素不得檢出[4]。因此，探討快速、便捷的氯霉素殘留檢測方法也引起了世界各國的廣泛關注。

目前氯霉素殘留分析方法很多[5-6]，主要有酶聯免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[7-9]、氣相色譜法(gas chromatography，GC)[10]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[11-12]、氣相色譜-質譜聯用技術(gas chromatography-mass spectrometer， GC-MS)[13-14]、液相色譜串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometer，LC-MS-MS)[15]，膠體金免疫層析法(gold immunochromatographic assay，GICA)[16]亦可見報道。本實驗對膠體金免疫層析法和氣相色譜法測定動物產品中氯霉素殘留的方法進行比較研究，并對方法的回收率、精密度及檢測限進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 樣品及制備

實驗樣品為凍雞肉、凍魚肉、凍蝦仁，均購自市場。其中雞肉50份，魚肉30份，蝦仁28份。將樣品去皮、去骨后取肌肉，制成均質物，儲存于－18℃備前處理用。

1.1.2 試劑

氯霉素標準品(純度99.5%) 德國Dr Ehrenstorfer公司；氯霉素膠體金免疫層析法試劑盒(包括反應孔48個、氯霉素指示劑1瓶、檢測試紙片48片、10倍濃縮稀釋緩沖液) 大連普瑞康生物技術有限公司；C18固相萃取柱(填料量500mg，3mL)；乙酸乙酯、乙腈、正己烷(均為農殘級) 美國Tedia公司；4g/100mL氯化鈉溶液；BSTFA＋TMCS (99:1)衍生化試劑 美國Supelco公司。

1.1.3 儀器與設備

6890N型氣相色譜儀(配ECD檢測器) 美國安捷倫公司；JA-5002電子天平 上海精天電子儀器廠；AllegraTM21R臺式高速冷凍離心機.. 美國Beckman公司；R-205旋轉蒸發儀 德國Bu chi公司；漩渦混合器、NEVAP-11155氮吹儀、固相萃取SPE裝置、微量移液槍。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

GICA法：稱取樣品3g(精確到0.01g)，用6mL乙酸乙酯提取，3000r/min離心后吸取乙酸乙酯2mL置于10mL刻度離心管，氮氣流吹干；先用2mL正己烷溶解殘渣，再加入1mL稀釋緩沖液，漩渦混合10s，3000r/ min離心10min，棄去上層正己烷層，下層水相備用。

GC法：稱取樣品5g(精確到0.01g)，用乙酸乙酯30mL分2次提取，速度離心4000r/min，將提取液乙酸乙酯層合并轉移到100mL細口雞心瓶中，于溫度40℃水浴中，減壓旋轉蒸發至干。向雞心瓶中加15mL、4g/ 100mL氯化鈉溶液，再用20mL正己烷分兩次脫脂，除去上層正己烷相，水相保留備用。給每個樣品準備一根C18柱，依次用5mL甲醇和5mL水活化，將上一步脫脂得到的水相溶液注入C18柱，棄去流出液，用3mL水洗滌并抽干小柱，再用4mL乙腈將C18小柱中的氯霉素洗脫至5mL具塞離心管中，用氮氣吹干。加100μL衍生化試劑，蓋塞并旋渦混合10s，在60℃烘箱中反應30min。用氮氣流吹除多余的試劑，至樣品管剛好吹干為止。加入1mL正已烷定容，供GC(ECD)檢測。

1.2.2 GICA法分析步驟

用微量移液器吸取70μL水相溶液加入反應孔中，然后以試劑盒自帶小吸管加入氯霉素指示劑1滴(使用前充分搖勻)，充分振蕩混合5min。于待測反應孔中放入試紙片(白色端在下)，跑片10min后按按照試劑盒說明判定結果，判定時間不宜超過20min。

1.2.3 GC法測試條件

色譜柱：填料35%聚二苯基二甲基硅氧烷(DB-35)毛細管柱，規格長：30m，內徑0.25mm或0.32mm，膜厚0.25μm；載氣：氮氣；流量：1.2mL/min；尾吹氣流量：60mL/min；進樣口溫度：260℃；柱溫：采用程序升溫：初溫80℃，維持1min；30℃/min升至200℃，維持0min；然后6℃/min升至250℃，維持5min；最后設定30℃/min升至270℃，維持5min以確保所有的化合物已經流出；檢測器溫度：300℃；進樣方式：不分流進樣，分流吹掃時間0.75min；進樣量：1μL。

1.2.4 GC法精密度和準確度

方法準確度以回收率表示，而精密度以變異系數來表示。向空白樣品中分別添加0.3、0.5、1.5μg/kg三個水平的氯霉素標樣，每個添加量至少做3個平行，同時做3個空白樣。按1.2.1節方法進行前處理，氣相色譜法檢測定量，計算回收率及各添加水平的變異系數。

1.2.5 GICA方法驗證

稱取樣品5g(精確到0.01g)，向樣品中分別添加10μg/L氯霉素標樣150、250、750μL，即添加水平為0.3、0.5、1.5μg/kg三個水平，每個水平設16個平行，同時做8個空白樣，按1.2.1節前處理和1.2.2節測定。

用膠體金免疫層析法對108個禽、水產品進行篩選，陽性樣品用氣相色譜法驗證，陰性樣品同時用氣相色譜法測定。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

圖1 氯霉素標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of chloramphenicol standard

氯霉素標準曲線：以1、10、20、50、100μg/L氯霉素標準工作液衍生后進樣，測定其峰面積值，以峰面積對質量濃度做工作曲線。結果表明氯霉素保留時間為15.41min，在1～100μg/L質量濃度范圍內呈良好線形關系，回歸方程為Y＝4×106x＋2×107，r2＝0.997。氣相色譜儀檢測氯霉素標準品的色譜圖見圖1。

2.2 GC法精密度和準確度

實驗的準確度以回收率表示，精密度以變異系數來表示，加標量為0.3、0.5、1.5μg/kg，精密度和準確度見表1。

表1 GC法測定的準確度和精密度測定結果Table 1 Accuracy and precision of GC

從表1可看出，向樣品中添加0.3、0.5、1.5μg/kg三個水平的氯霉素標準品時，平均回收率分別為78.1%、85.3%和88.3%，變異系數為5.3%～9.0%，方法重復性較好。

2.3 GICA法檢測結果

GICA法的原理是將特異性抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，當該硝酸纖維素膜一端浸入樣品時，由于毛細管作用，樣品沿著膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體特異性結合，使免疫膠體金染色的該區域顯示一定的顏色，從而實現特異性免疫診斷。

向空白樣品中分別添加0.3、0.5、1.5μg/kg三個水平的氯霉素標樣，每個水平設16個平行，同時做8個空白樣，按1.2.1前處理和1.2.2節測定，結果見表2。

表2 GICA法樣品檢測結果Table 2 Results of sample detection by GICA

從表2可知，8個空白樣品檢測結果為陰性；16個添加0.3μg/kg氯霉素標準品的樣品，經檢測有2個樣品為陽性，14個樣品為陰性；添加0.5、1.5μg/kg氯霉素標準品的樣品，檢測結果為陽性，檢出率為100%。

2.4 檢測限

膠體金免疫層析法試劑盒檢測限：取試劑空白、0.30、0.60μg/L的氯霉素標準品各8份，按1.2.2節測定，結果見表3。

表3 GICA法標準品檢測結果Table 3 Results of standard CPA detection by GICA

由表3可知，膠體金免疫層析法對0.3μg/L及以上質量濃度的標準品均能檢出，試劑盒檢測限為0.3μg/L。

樣品檢測限：從表2看出，向16個樣品中添加0.5μg/kg水平的氯霉素標準品均能檢出，初步確定該法檢測限至少為0.5μg/kg。根據《農業部公告781-1－2006動物源食品中氯霉素殘留量的測定：氣相色譜-質譜法》(確證方法)中定量限為0.5μg/kg，GICA法的檢測限能滿足篩選要求。

氣相色譜法最低檢測限按照信噪比RSN＝3計算，得該方法檢測限為0.3μg/kg。

2.5 GICA法和GC法檢測實際樣品結果比較

用膠體金免疫層析法對108個禽、水產品進行檢測，篩選出3個陽性樣品(按檢測限0.5μg/kg判定)，用氣相色譜法驗證亦為陽性；其余105個樣品用膠體金免疫層析法篩選為陰性，經氣相色譜法檢測均為陰性(檢測限0.3μg/kg)，結果見表4。

表4 GICA法和GC法檢測結果比較Table 4 Comparison of determination results of chloramphenicol residues in 108 samples by GICA and GC

由表4可見，GICA法篩選出的3個陽性樣品經GC檢測結果均在0.5μg/kg以上，而陰性樣品均低于0.3μg/kg，顯示兩種檢測方法結果的吻合度較高。其中陽性雞肉樣品氯霉素濃度在檢測限附近，用GICA法亦能明顯判為陽性。表4的結果表明GICA法篩選假陽性率和假陰性率都為0，適用于動物產品中氯霉素殘留篩選。

3 討 論

目前對動物產品中氯霉素殘留的主要方法為氣相色譜法、氣質聯用法、液質聯用法、液相色譜法、酶聯免疫法，而膠體金免疫層析法的運用才剛剛起步。氣相色譜法、氣質聯用法、液質聯用法靈敏度高、準確性好，但前處理繁瑣，檢測成本高，且需要昂貴的儀器；液相色譜法檢測限過高，達不到出口產品殘留限要求，目前使用不多；酶聯免疫法是目前廣泛使用的氯霉素殘留篩選方法之一，其精密度與準確度都很高，但陽性結果仍需經氣相色譜法、氣質聯用法確證。

用膠體金免疫層析法對動物產品中氯霉素殘留進行篩選，能在幾小時內檢測幾十到上百個樣品，且不需要復雜的儀器設備，樣品預處理簡單，檢測成本低，作為一種快速篩選手段，能大大提高檢測效率，在現場監控和基層檢測中有著廣闊的推廣應用前景。但目前篩選法的檢測標準極少，檢測限(即陽性濃度標準)不統一，給檢測結果判定帶來一定困難，對篩選可疑結果需用色譜方法進行確證。

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Comparative Applications of Colloidal Gold Immunochromatographic Assay and Gas Chromatography for the Determination of Chloramphenicol Residues in Food Products of Animal Origin

SONG Hong-bo，CHEN Jun，WANG Dong，FANG Lin，YU Wen-jie，CHU Fang

(Liyang Testing Center, Institute of Supervision and Inspection Product Quality of Jiangsu Province, Liyang Agricultural, Domestic and Aquatic Products Quality Supervision and Testing Center, Liyang 213300, China)

Colloidal gold immunochromatographic assay (GICA) and gas chromatography (GC) was separately used for the analysis of chloramphenicol (CAP) residues in creatural products. Samples were spiked with 0.3, 0.5μg/kg and 1.5μg/kg CAP and determined by the methods. CAP residues at concentrations above 0.5μg/kg could be detected by GICA. The average recovery rates of GC were 78.1%, 85.3% and 88.3%, respectively with relative standard deviation (RSD) of 5.3%－9.0% and the detection limit was 0.3μg/kg. Three positive samples and other 105 samples analyzed by GICA were confirmed by GC and no false positive and negative samples were observed. Therefore, GICA is a rapid, accurate, reproducible and suitable to be used for rapid in situ screening of CAP residues in food products of animal origin, while GC is sensitive and suitable to be used for quantification of positive samples.

food products of animal origin；chloramphenicol；GICA；GC

TS207.3

A

1002-6630(2012)08-0229-04

2011-04-05

宋紅波(1980—)，女，助理研究員，碩士，主要從事食品安全檢測技術研究。E-mail：lichenlsong@yahoo.com.cn